摘 要：目的：利用焦慮動(dòng)物模型研究桑葉抗焦慮作用及其物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（蒸餾水 0.375 mL）、地泮對(duì)照組（0.0023 g/kg）、桑葉組（4.5 g/kg）、真空處理桑葉組（4.5 g/kg），每組 10只，雌雄各半，灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)灌胃 4 d 后，依次采用自主活動(dòng)儀、明暗箱、高架十字迷宮考察**對(duì)小鼠的行為影響；高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后小鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)含量。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，真空處理桑葉組可顯著增加小鼠在明箱停留時(shí)間（P<0.05），并顯著提高小鼠開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（OT％）（P<0.05）。小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)顯示，真空處理桑葉組、桑葉組均可顯著降低小鼠腦組織 5-羥色胺（5-HT）濃度（P<0.05），去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）濃度也有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：桑葉具有抗焦慮作用，且其物質(zhì)基礎(chǔ)可能為 γ-氨基丁酸（GABA）。

關(guān)鍵詞：桑葉；抗焦慮；γ-氨基丁酸；明暗箱；高架十字迷宮

 桑葉抗焦慮作用研究之高架十字迷宮、明暗箱測(cè)試

焦慮癥是一種具有持久性焦慮、恐懼、緊張情緒和植物神經(jīng)活動(dòng)障礙的腦機(jī)能失調(diào)，常伴有運(yùn)動(dòng)性不安和軀體不適感。臨床**焦慮癥的**主要有苯二氮卓類(lèi)、非苯二氮卓類(lèi)、抗抑郁藥以及腎上腺受體阻滯劑等，盡管這些**見(jiàn)效快、療效好，但易產(chǎn)生耐受性，長(zhǎng)期應(yīng)用可產(chǎn)生依賴(lài)性及突然停藥產(chǎn)生戒斷反應(yīng)等。因此，尋找一種**有效的抗焦慮**迫在眉睫。

桑葉是一種藥食兩用產(chǎn)品，治病入藥始于東漢，具有疏散風(fēng)熱、清肺**、平肝明目、涼血止血的功效?，F(xiàn)代藥理研究證明桑葉具有降血糖、***、**、抗病毒等作用，但對(duì)桑葉抗焦慮作用的研究報(bào)道極少。筆者等運(yùn)用自主活動(dòng)儀、明暗箱和高架十字迷宮多種焦慮動(dòng)物模型觀察桑葉的抗焦慮作用，并初步探究其抗焦慮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明種小鼠，初始質(zhì)量 18-22 g，雌雄各半，購(gòu)自重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 **與試劑

桑葉，采自重慶北碚西南大學(xué)桑之源基地，經(jīng)西南大學(xué)李學(xué)剛教授鑒定；地泮片劑（華中藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20120601）；去甲腎上腺素（美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)：1001423402）；多巴胺（美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)：101171997）；5-羥色胺（美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)：1001344074）；無(wú)水乙醇（AR）；磺基水楊酸；高氯酸（AR）；乙酸鈉（色譜純）；乙酸（AR）；甲醇（色譜純）；乙二胺四乙二鈉鹽。

1.3 儀器

LC-6AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；Auanti J-30I 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JA2003B 電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；F6/10-6G 超細(xì)勻漿器 （弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）。
備注：XR-XZ301 自主活動(dòng)儀（上海欣軟信息科技有限公司）；自制明暗箱；XR-XG201 十字迷宮跟蹤分析系統(tǒng) （上海欣軟信息科技有限公司）；

1.4 方法

1.4.1 真空處理的桑葉水提醇沉浸膏的制備 取新鮮桑葉 500 g，置于真空裝置中，于 20 ℃靜置 8 h。用蒸餾水回流提取 3 次，合并，減壓濃縮到 150-200 mL，添加 3 倍體積的 95%乙醇，放置冷卻 12 h 以上，過(guò)濾，上清液減壓濃縮至 200 mL 左右，備用。

1.4.2 動(dòng)物分組及給藥 取 40 只 SPF 級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（蒸餾水 0.375 mL）、陽(yáng)性**地泮對(duì)照組（0.002 3 g/kg）、桑葉組（4.5 g/kg）、真空處理桑葉組（4.5 g/kg）共 4 組，每組 10 只。桑葉、真空處理桑葉制成水提醇沉浸膏后給藥，連續(xù)灌胃給藥 6 d，1 次/d。

1.5 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 桑葉對(duì)小鼠自主活動(dòng)行為的影響 在第 4 天灌胃后分別于 0 h、1 h、2 h、3 h 將小鼠放入自主活動(dòng)儀中測(cè)定 5 min 內(nèi)小鼠的活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)。

1.5.2 桑葉對(duì)小鼠明暗箱行為的影響 在第 5 天灌胃 30 min后，將小鼠置于明暗箱的明箱中央，頭朝暗箱，記錄 5 min內(nèi)小鼠的穿箱次數(shù)、小鼠在明箱的滯留時(shí)間及跨格次數(shù)。

1.5.3 桑葉對(duì)小鼠高架十字迷宮行為的影響 在第 6 天灌胃后的 30 min，將小鼠置于迷宮中央，頭朝閉臂。分別記錄 5 min 內(nèi)小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂和封閉臂的次數(shù)、停留時(shí)間

及在兩臂滯留的總時(shí)間。計(jì)算小鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)占總?cè)氡鄞螖?shù)（進(jìn)入開(kāi)臂和閉臂的次數(shù)之和）的百分率（OE%）及在開(kāi)臂滯留時(shí)間占總?cè)氡蹠r(shí)間（在開(kāi)臂和閉臂滯留時(shí)間之和）的百分率（OT%）。

1.6 小鼠腦組織內(nèi) NE、DA、5-HT 含量測(cè)定

1.6.1 樣品預(yù)處理 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，立即斷頭處死小鼠，迅速取出腦組織，稱(chēng)重后放入加 500 μL 0.4 mol/LHClO4的 Ependet 離心管中，冰浴勻漿。渦旋后置冷凍離心

機(jī) （4 ℃），10 000 r/min 離 心 10 min， 將 上 清 液 轉(zhuǎn) 入Eppen-dorf 離心管中，再次離心，取上清液，用 HPLC 法測(cè)定腦組織中 NE、DA、5－HT 含量。

1.6.2 色譜條件 色譜柱為 Hypersil ODS2高效液相色譜柱 （4.6 mm × 200 mm，5 μm）。流動(dòng)為 0.1 mol/L 的CH3COONa 緩 沖液 - 甲醇（9 ∶1），流速 1.0mL/min，進(jìn)樣量每次 20 μL。發(fā)射波長(zhǎng) 330 nm，激發(fā)波長(zhǎng) 290 nm。柱溫：25 ℃。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用 SPSS17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析 （One-way ANONA） 進(jìn)行檢驗(yàn)，多組間比較采用Duncan’s Test 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以 X±S 表示。

2 結(jié)果

2.1 桑葉對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

與空白對(duì)照組比較，**組在灌胃后 2 h，小鼠在自主活動(dòng)儀中的活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)均減少，且真空處理桑葉組與空白對(duì)照組有顯著性差異（P<0.05）。

2.2 桑葉對(duì)小鼠明暗箱行為的影響

與空白對(duì)照組比較，**組均能增加小鼠跨格次數(shù)、在明箱的滯留時(shí)間。兩個(gè)桑葉組小鼠在明箱內(nèi)的跨格次數(shù)與空白對(duì)照組比較差異顯著（P<0.05）。同時(shí)，真空處理桑葉組小鼠在明箱滯留時(shí)間與空白對(duì)照組比較差異顯著（P<0.05）。

2.3 桑葉對(duì)小鼠高架十字迷宮行為的影響

與空白對(duì)照組相比，**組均能增加小鼠開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比（OE%）、開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（OT%）。地泮組及真空處理桑葉組 OE%、OT%與空白對(duì)照組比較均有顯著性差異（P<0.05）。

2.4 桑葉對(duì)小鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響與空白對(duì)照組相比，**組小鼠腦組織中 NE、DA、5-HT 含量均降低。兩個(gè)桑葉組小鼠腦組織中 5-HT 含量與空白對(duì)照組比較有顯著性差異 （P<0.05）。3 討論

桑葉中 GABA 的平均含量可達(dá) 2.26 mg/g，真空處理后的桑葉中 GABA 的含量將會(huì)增加。GABA 是**神經(jīng)系統(tǒng)中含量*多、*重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)與下一個(gè)神經(jīng)元膜上的受體結(jié)合，開(kāi)放氯離子通道，使氯離子內(nèi)流，使細(xì)胞膜超極化，抑制動(dòng)作電位的發(fā)生，從而阻止焦慮相關(guān)的信息抵達(dá)腦指示**。本研究結(jié)果顯示，桑葉和真空處理后的桑葉對(duì)小鼠的**神經(jīng)系統(tǒng)均有抑制作用，且后者作用強(qiáng)于前者，說(shuō)明桑葉中 GABA 含量越高，其抑制作用越明顯。
明暗箱、高架十字迷宮都是評(píng)價(jià)**抗焦慮作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀ＩＨ~水提醇沉浸膏和真空處理后的桑葉水提醇沉浸膏都表現(xiàn)出對(duì)小鼠的抗焦慮作用，且真空處理后的桑葉組較空白對(duì)照組有顯著性差（P<0.05），說(shuō)明桑葉中的 GABA 含量越高，其抗焦慮作用越明顯。5-HT 是與心境障礙相關(guān)的關(guān)鍵性神經(jīng)遞質(zhì)，目前研究認(rèn)為 5-HT 的多個(gè)受體皆與焦慮障礙有密切關(guān)系。其中，5-HT3受體屬于配體門(mén)控離子通道偶聯(lián)受體，激活 5-HT3受體可以開(kāi)放陽(yáng)離子通道而觸發(fā)細(xì)胞快速去極化，導(dǎo)致胞漿內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，繼而誘發(fā)神經(jīng)元釋放遞質(zhì)。而抑制性神經(jīng)遞質(zhì) GABA 使細(xì)胞膜超極化，不容易去極化，導(dǎo)致 5-HT3受體不能激活，從而抑制 5-HT 釋放。此外，5-HT1B、5-HT2C與 GABA 也有相互調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，焦慮癥的產(chǎn)生還與 NE、DA 的釋放有關(guān)，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，焦慮模型小鼠腦組織內(nèi)的NE、DA、5-HT 都有升高，而使用抗焦慮**的小鼠腦內(nèi)這 3 種神經(jīng)遞質(zhì)水平會(huì)降低。本研究用 HPLC 色譜法分析行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后的小鼠大腦中 NE、DA、5-HT 含量，**組 3 種神經(jīng)遞質(zhì)含量較空白組均降低，證明了桑葉的抗焦慮作用。桑葉抗焦慮作用研究之高架十字迷宮、明暗箱測(cè)試

綜上所述，桑葉抗焦慮作用可能是桑葉中的 GABA 作用于**神經(jīng)系統(tǒng)，與 NE、DA、5-HT 協(xié)同作用阻礙焦慮信息的傳達(dá)，從而產(chǎn)生抗焦慮作用，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。