［摘要］ 目的: 觀察石菖蒲抗焦慮作用并探討其作用機制。方法: 將昆明種雄性小鼠隨機分為 8 組( n =12) ，分別為模型對照組、陽性對照組、石菖蒲揮發(fā)油高、中、低劑量組( 10，5，2. 5 g·kg－ 1·d－ 1) ，石菖蒲水煎液高、中、低劑量組( 20，15，10 g·kg－ 1·d－ 1) ，模型組 ig 生理鹽水，陽性組 ig西泮( 2. 5 mg·kg－ 1·d－ 1) ，連續(xù) ig 給藥 5 d，末次給藥 0. 5 h 后進行高架十字迷宮實驗和明暗箱實驗，觀察石菖蒲對小鼠焦慮行為的干預作用。用酶聯**法測定小鼠腦內 γ-氨基丁酸( GABA) ，谷氨酸( Glu) ，五羥色胺( 5-HT) 的含量。結果: ①石菖蒲揮發(fā)油高、低劑量組和水煎液中、低劑量組能明顯增加小鼠在高架十字迷宮裝置上的開臂滯留時間( OT%，P ＜0. 05) ，能明顯增加小鼠的開臂進入次數( OE%，P ＜0. 05) 。②石菖蒲揮發(fā)油劑量組和水煎液高劑量組能顯著增加小鼠腦內 GABA 的含量( P ＜0. 05) ; 石菖蒲揮發(fā)油中、低劑量組和水煎液 3 個劑量組能顯著降低小鼠
腦內 Glu 的含量( P ＜0. 05) ; 石菖蒲揮發(fā)油 3 個劑量組和水煎液 3 個劑量組能顯著降低小鼠腦內 5-HT 的含量( P ＜0. 05) 。結論: 石菖蒲揮發(fā)油和水煎液在小鼠高架十字迷宮模型和明暗箱模型上均表現出抗焦慮作用，其作用效果與西泮類似。作用機制可能與提高** GABA 含量，降低 Glu 和 5-HT 含量有關。石菖蒲揮發(fā)油和水煎液的抗焦慮作用
［關鍵詞］ 石菖蒲; 高架十字迷宮; 明暗箱; 抗焦慮
石 菖 蒲 為 天 南 星 科 植 物 石 菖 蒲 Acorustatarinowii Schott． 的根莖，始載于《神農本草經》，具有化濕開胃，開竅豁痰，醒神益智的功能，用于脘痞不饑，噤口下痢，神昏癲癇，健忘耳聾。石菖蒲的主要有效部位是其揮發(fā)性成分，其中發(fā)揮作用的主要活性成分是 α-細辛醚和 β-細辛醚。大量實驗表明，石菖蒲揮發(fā)油既具有興奮、抗抑郁、抗缺氧作用，又具有**、催眠、抗驚厥作用，同時也有較好的益智、腦保護作用。本實驗是基于其**、催眠作用，對其抗焦慮作用進行觀察。
1 材料
1. 1 儀器 XR-XG201型高架十字迷宮裝置( 上海欣軟信息科技有限公司) ，小鼠明暗箱裝置［實驗室自制，一箱為明室( 15 cm ×10 cm ×20 cm) ，另一箱為暗室( 25 cm ×10 cm × 20 cm) ，兩室有一圓形孔相通］，TGL-16gＲ 型高速冷凍離心機 ( 上海安亭科學儀器廠) ，微量移液器( 上海雷勃分析儀器有限公司) ，XK96 型快速混勻器( 中國姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司) ，EL-S 型電子天平( 常州市天之平儀器設備有 限 公 司 ) ，680 型 酶 免 儀 ( 美 國 Bio-ＲadLaboratories) ，JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機( 寧波新芝生物科技股份有限公司) 。
1. 2 **與試劑 石菖蒲購于河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，產地安徽，批號 120501，經河南中醫(yī)學院陳隨清教授鑒定為天南星科植物石菖蒲 Acorustatarinowii Schott． 的根莖，質量標準符合《中國藥典》2010 年版一部要求。***( 天津力生制藥股
份有限公司，批號 1101001) 。氯化鈉注射液( 河南雙鶴華利藥業(yè)有限公司，批號 13020605B) 。聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯( 吐溫-80，天津市永大化學試劑開發(fā)中心，化學純，批號 20080328) 。γ-氨基丁酸( GABA) 檢測試劑盒( 批號20130202B) ; 谷氨酸( Glu) 檢測試劑盒 ( 批號 20130202B) ; 五羥色胺( 5-HT) 檢測試劑盒( 批號 20130202B) 均為 Ｒ＆D生產。
1. 3 動物 SPF 級昆明種小鼠 96 只，雄性，體重18 ～ 22 g，購自于鄭州大學實驗動物中心，許可證號SCXK( 豫) 2010-0002。分籠飼養(yǎng)在( 20 ± 2) ℃ 的動物室，專人飼養(yǎng)和管理。
2 方法
2. 1 **制備
2. 1. 1 石菖蒲揮發(fā)油的提取 揮發(fā)油提取采用文獻方法，精密稱定石菖蒲飲片 60 g，加 8 倍量水，置 1 000 mL 圓底燒瓶中，浸泡4 h，加一定量的水與玻璃珠數粒，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，將燒瓶置電熱套中加熱至沸，并保持微沸6 h，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端活塞，將水緩緩放出，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉脫水，得到橙黃色油 0. 6 mL。揮發(fā)油用吐
溫-80、氯化鈉注射液配制成 1 g·mL－ 1的溶液( 按生藥量計算，下同) ，備用。
2. 1. 2 石菖蒲水煎液的制備 采用文獻方法，精密稱取石菖蒲飲片 120 g，加 10 倍量的水，浸泡1 h?；亓魈崛?nbsp;1 h，殘渣用 1 500 mL 水煎煮 0. 5 h。合并兩次濾液，濃縮成 2 g·mL－ 1的溶液，備用。
2. 2 對高架十字迷宮和明暗箱試驗的影響
2. 2. 1 分組與給藥 將 96 只小鼠不限食水飼養(yǎng)3 d，禁食 24 h 后，稱重，標記。隨機分為模型對照組( 生理鹽水) ，陽性對照組( 西泮 2.5 mg·kg－ 1·d－ 1) ，揮發(fā)油高、中、低劑量組( 10，5，2. 5 g·kg－ 1·d－ 1) ，水提液高、中、低劑量組( 20，15，10 g·kg－ 1·d－ 1) ，每組 12 只。給藥體積 10 mL·kg－ 1，連續(xù)給藥 5 d。
2. 2. 2 行為學試驗 末次給藥 0. 5 h 后進行高架十字迷宮實驗和明暗箱實驗，記錄小鼠在高架十字迷宮上 5 min 進入開臂的次數比( OE%) 、在開臂的停留時間比( OT%) 和小鼠在明暗箱中 10 min 的穿箱次數( TT) 。
2. 3 小鼠腦組織的處理 小鼠行為學實驗結束后，立即斷頭處死，冰臺上迅速剝離全腦，用 1/萬天平分別精密稱重; 以腦組織( g) ∶ 生理鹽水( mL) 1∶ 9的比例加入冰冷的生理鹽水，低溫下用超聲波細胞粉碎機進行勻漿; 勻漿液在4 ℃，6 000 r·min－ 1離心10min，取上清液置 5 mL 離心管中，即得 10% 的小鼠腦勻漿液，然后進行酶聯**吸附試驗，分別測定腦組織中 GABA，Glu 和 5-HT 的含量。石菖蒲揮發(fā)油和水煎液的抗焦慮作用
2. 4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 17. 0 軟件對結果進行單因素方差分析，實驗數據以 x珋 ± s 表示，組間比較采用 t 檢驗，以 P ＜0. 05 為有統(tǒng)計學差異。
3 結果
3. 1 對小鼠高架十字迷宮和明暗箱行為的影響
與模型對照組比較，陽性對照***組，石菖蒲揮發(fā)油高、低劑量組和水煎液中、低劑量組能明顯增加小鼠在高架十字迷宮裝置上的開臂滯留時間( P ＜0. 05) ; 陽性對照組，石菖蒲揮發(fā)油高、中劑量組和水煎液中、低劑量組能明顯增加小鼠在高架十字迷宮裝置上的開臂進入次數比( P ＜ 0. 05) ; 陽性對照組能明顯增加小鼠明暗箱穿箱次數( P ＜ 0. 05) ，石菖蒲揮發(fā)油中、低劑量組和水煎液的低劑量組有增加小鼠明暗箱穿箱次數的作用趨勢，沒有顯著性差異; 石菖蒲揮發(fā)油和水提液表現出與***相似的抗焦慮作用。
3. 2 小鼠腦內 GABA，Glu 和 5-HT 含量的影響與模型對照組比較，陽性對照組，石菖蒲揮發(fā)油高、中、低劑量組和水煎液高劑量組能顯著增加小鼠腦內 GABA 的含量( P ＜ 0. 05) ; 陽性對照組，揮發(fā)油中、低劑量組和水煎液高、中、低劑量組能顯著降低小鼠腦內 Glu 的含量( P ＜0. 05) ; 陽性對照組，石菖蒲揮發(fā)油高、中、低劑量組和水煎液高、中、低劑量組能顯著降低小鼠腦內 5-HT 的含量( P ＜ 0. 05) 。
4 討論
高架十字迷宮裝置和明暗箱探尋裝置是公認的焦慮實驗裝置。小鼠在高架十字迷宮裝置中會出現緊張、擔心、恐懼或發(fā)作性驚恐等種種焦慮行為，實驗指標以進入開臂次數百分比( OE%) 、開臂滯留時間百分比( OT%) 來反映動物的焦慮狀態(tài)，焦慮動物
的 OE% 和 OT% 明顯降低，經典抗焦慮*****則使兩者升高，通過實驗筆者發(fā)現石菖蒲顯示出與***相似的作用。明暗箱模型以明箱中的亮光作為刺激源，由于小鼠趨暗的習性，小鼠條件反射本能是向暗箱爬行，當它被置于明箱中時，會表現出焦慮神經癥的癥狀。小鼠在正常情況下更傾向于在昏暗一邊活動，但當焦慮減輕時，就會增加在明暗兩邊轉換次數以及在明亮一邊探尋行為的次數，用此來評價實驗動物焦慮的程度。本實驗結果顯示，陽性對照組能明顯增加小鼠明暗箱穿箱次數( P ＜0. 05) ，石菖蒲揮發(fā)油中、低劑量和水煎液低劑量有增加小鼠明暗箱穿箱次數的作用趨勢。腦內存在的氨基酸，不僅是合成多種蛋白質的原料，同時還具有突觸傳遞功能。Glu 屬于興奮性氨基酸，在**興奮性氨基酸中占主導地位;GABA 屬于抑制性氨基酸，是**神經系統(tǒng)的主要抑制性神經遞質。在**神經系統(tǒng)中，*重要的抑制性氨基酸是 γ-氨基丁酸，其在腦組織內廣泛存在。40%以上的抑制性神經傳導由 GABA 介導，GABA 可能通過激活受體而對離子通道構成影響，造成突觸后膜超級化，抑制突觸后電位產生，抑制神經元放電，從而發(fā)揮抗焦慮作用，因此 GABA 在控制神經元興奮性方面，起著非常重要的作用。5-HT 廣泛存在于哺乳動物組織中，特別在大腦皮層
及神經突觸內含量很高，屬于生物原胺類神經遞質，是調節(jié)神經活動的一種重要物質。** 5-HT 系統(tǒng)功能失調會導致抑郁、焦慮、驚恐、強迫等多種精神障礙。本實驗結果顯示，石菖蒲揮發(fā)油高、中、低劑量組和石菖蒲水煎液高劑量組能顯著提高小鼠腦內的 γ-氨基丁酸含量( P ＜0. 05) ; 石菖蒲揮發(fā)油中、低劑量組和石菖蒲水煎液高、中、低劑量組能顯著降低小鼠腦內的 Glu 含量( P ＜ 0. 05) ; 石菖蒲揮發(fā)油和水煎液的抗焦慮作用
高、中、低劑量組和水煎液高、中、低劑量組能顯著降低小鼠腦內的 5-HT 的含量( P ＜0. 05) ，說明石菖蒲的抗焦慮作用，可能與提高 GABA 含量，降低谷氨酸與 5-HT 含量有關。有研究表明，石菖蒲的揮發(fā)性成分和水煎液是其主要的有效部位，因其能夠降低興奮性氨基酸的水平，從而發(fā)揮**作用; 石菖蒲的揮發(fā)性成分、水煎液和去油水煎液，可以減少興奮性氨基酸的神經毒性，是腦保護作用的主要活性部位; 石菖蒲各提取部位，通過不同的途徑，呈現出對**神經系統(tǒng)的保護作用。據此我們選取石菖蒲的揮發(fā)油、水煎液和去油水煎液進行抗焦慮藥效實驗，通過多次預實驗，我們發(fā)現石菖蒲的去油水煎液部位抗焦慮效果不好，因此舍棄去油水煎液部位。石菖蒲抗焦慮的活性物質，尚有待于進一步研究探討。
