1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 50 只健康C57BL/6J雄性小鼠，SPF級(jí)，10～12 周齡，體質(zhì)量23～26 g。購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證：SCXK（滬）2012-0002。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度21～25 ℃，濕度50%～60%，光照12 h，期間正常飲水、攝食。

1.2 主要試劑和儀器 丁香精油，純度100%，原料產(chǎn)地為法國，購自廣東揭陽光合生物科技有限公司。精油，純度100%，原料產(chǎn)地為印度，購自廣東揭陽光合生物科技有限公司。TRNzol A+總RNA提取試劑、FastQuant RT Kit（With gDNase）購于北京天根生化有限公司；ssoFast熒光定量試劑購于美國Bio-Rad公司；小鼠血清5-HT ELISA試劑盒購于南京建成生物工程研究所。冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號(hào)：5424R）；普通梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號(hào)：T100TM Thermal Cycler）；醫(yī)用壓縮式霧化器（陜西民起電子科技有限公司，型號(hào)：MQB-13）；懸尾實(shí)驗(yàn)觀察箱（上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào)：XR-XX203）；強(qiáng)迫游泳玻璃缸（上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào)：XR-XQ202）。

1.3動(dòng)物建模、分組及干預(yù)**

1.3.1 小鼠抑郁模型建立：50 只C57BL/6J小鼠經(jīng)體質(zhì)量、懸尾測試實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swim test，F(xiàn)ST）及血清5-HT濃度測定初篩后選取各指標(biāo)相近的45只小鼠。隨機(jī)從中挑取8 只小鼠作為正常組，剩下的37只小鼠采用慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激模型（chronicunpredictable mild stress，CUMS）和孤養(yǎng)（單鼠單籠飼養(yǎng)）的建模方法[5]，連續(xù)應(yīng)激28 d使其抑郁。應(yīng)激包括24 h禁食禁水，冷水游泳（12 ℃，5 min），傾斜鼠籠（45°傾，8 h），搖鼠籠（1次/s，5 min），夾尾60 s，潮濕籠子8 h，熱水游泳（37 ℃，5 min），夜間照明12 h，夾尾90 s。以上9種刺激每天隨機(jī)給予1種，隔天刺激不重復(fù)，平均每種刺激3次，第18天不予刺激。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過28 d的刺激后，與正常和造模前小鼠相比，小鼠TST和FST不動(dòng)時(shí)間百分比應(yīng)顯著延長，體質(zhì)量顯著降低或無明顯差異，血清5-HT濃度顯著下降。

1.3.2 分組和**方法：從抑郁癥造模成功的小鼠中篩選出32 只小鼠并隨機(jī)分為4 組。丁香組和莉組：分別采用丁香精油和莉精油進(jìn)行霧化**，分別取50 μL精油和60 mL常溫蒸餾水混勻后，加入霧化機(jī)中。蒸餾水組：采用蒸餾水進(jìn)行霧化**，取60 mL常溫蒸餾水加入霧化機(jī)。將霧化機(jī)的噴霧口接入小鼠飼養(yǎng)籠內(nèi)，打開霧化機(jī)，讓小鼠持續(xù)吸入1 h，每天3 次，持續(xù)28 d，期間正常飲水、攝食。抑郁組：和正常組一樣，不予任何**措施，正常飼養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 TST：將小鼠遠(yuǎn)端尾部約1.5 cm固定后，頭向下懸掛，距離地面約35 cm。記錄時(shí)間總長為360 s，測定指標(biāo)為懸掛時(shí)靜止不動(dòng)的時(shí)間百分比，以此反映小鼠無助程度。

SuperTst懸尾實(shí)驗(yàn)分析軟件：http://www.bjhstn.com/s02/product/2014/06/17/20368117.html

1.4.2 FST：將小鼠放入直徑為25 cm，高30 cm的透明玻璃水缸里，內(nèi)注有15 cm高的水，水溫為21～25 ℃，總記錄時(shí)間為360 s，記錄的數(shù)據(jù)為120～360 s時(shí)間內(nèi)，小鼠漂浮不動(dòng)或輕微肢體活動(dòng)的時(shí)間百分比，用來反映小鼠的無助程度。

SuperFst強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)分析軟件：http://www.bjhstn.com/s02/product/2014/06/11/20137130.html

1.4.3 體質(zhì)量：分別于造模前、造模后、**后，記錄各組小鼠體質(zhì)量情況，以反映造模后、**后小鼠生理情況。

1.4.4 血清5-HT測試：小鼠剪尾取血50 μL，室溫靜置2 h，使血液充分凝固，室溫3 000 r/min離心15 min，取20 μL上清液，加入等體積0.9%氯化鈉溶液稀釋至40 μL，按照ELISA說明書進(jìn)行操作，*后用酶標(biāo)儀測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

1.4.5 OR 基因檢測：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）檢測小鼠OR 基因表達(dá)水平，先用TRIzol法提取小鼠嗅球區(qū)域組織總RNA。提取的RNA溶于DEPC處理水后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外-可見分光光度計(jì)測其OD260/280值檢測RNA純度和濃度。cDNA模板的合成則按照反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)手冊(cè)使用FastQuant cDNA**鏈合成試劑盒合成cDNA。反應(yīng)體系包括10 μL反應(yīng)體系一：2 μL 5×gDNA Buffer、1 μg RNA、RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到10 μL；10 μL反應(yīng)體系二：2 μL 10×Fast RT Buffer、1 μL RT Enzyme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix和5 μL RNase-Free ddH2O。

先將體系一于42 ℃孵育3 min后立即放置在冰上，然后將反應(yīng)體系二全部加入反應(yīng)體系一中；*后將混合反應(yīng)體系42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，并4 ℃保存。合成的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨纤袠悠肪O(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。為了探索抑郁癥與嗅覺反應(yīng)之間的關(guān)系，研究測定了**后相同周齡各組小鼠的13 個(gè)OR 基因（MOR11、MOR1、MOR124、MOR16、MOR378、MOR544、MOR19、MOR744、MOR63、MOR148、MOR9、MOR151和MOR15）表達(dá)水平。用GAPDH作為內(nèi)參基因。用做RT-qPCR的所有基因的引物見表1。每個(gè)PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μLSupermix，1 μL正向引物（10 μmol/L），1 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL cDNA，7 μL**蒸餾水。采用的qPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 3 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s和70 ℃ 10 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平采用Ct 值法的相對(duì)定量法計(jì)算。計(jì)算公式為2-ΔΔCt 來計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，其中：ΔΔCt =ΔCt 目的基因-ΔCt 正常組基因，ΔCt =Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用 ±s 表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時(shí)，方差齊性采用LSD法，方差不齊采用Games-Howell法，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量變化 造模前，各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。正常組小鼠在正常飼養(yǎng)28 d后，隨著年齡的增長，其體質(zhì)量顯著增加（P ＜0.05）。其余4 組小鼠經(jīng)過28 d造模成功后體質(zhì)量與各自造模前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但是都顯著輕于相同周齡的正常組（P ＜0.05）。采用相應(yīng)的芳香物質(zhì)**28 d后，丁香組及莉組小鼠體質(zhì)量與造模后比明顯增加（P ＜0.05），且與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。蒸餾水組和抑郁組小鼠體質(zhì)量與**前相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），且顯著低于同周齡正常組（P ＜0.05）

2.2 懸尾不動(dòng)時(shí)間百分比變化 造模前，各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間百分比相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。造模后，丁香組、莉組、抑郁組和蒸餾水組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間百分比較造模前明顯上升（P ＜0.05），顯著高于正常組。正常組小鼠在正常飼養(yǎng)28 d后，其懸尾不動(dòng)時(shí)間百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。采用相應(yīng)的芳香物質(zhì)**28 d后，丁香組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間百分比較造模后明顯下降（P ＜0.05），與正常組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。莉組、蒸餾水組和抑郁組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間百分比較造模后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但仍有顯著高于正常組（P ＜0.05）。

2.3 強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比變化 造模前，各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。正常組小鼠在正常飼養(yǎng)28 d后，其強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。造模后，丁香組、莉組、抑郁組和蒸餾水組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比較造模前明顯上升，且顯著高于正常組（P ＜0.05）。采用相應(yīng)的芳香物質(zhì)**28 d后，丁香組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比較**前顯著下降（P ＜0.05），且與正常組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。mo莉組、蒸餾水組和抑郁組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比較**前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但仍高于正常組（P ＜0.05）

2.4 小鼠血清5-HT濃度變化 造模前，各組小鼠血清5-HT濃度相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。正常組小鼠在正常飼養(yǎng)28 d后，其血清5-HT濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。造模后，丁香組、莉組、抑郁組和蒸餾水組小鼠血清5-HT濃度較造模前明顯下降，顯著低于正常組（P ＜0.05）。采用相應(yīng)的芳香物質(zhì)**28 d后，丁香組小鼠血清5-HT濃度較**前顯著提高（P ＜0.05），且與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。莉組、蒸餾水組和抑郁組小鼠血清5-HT濃度較造模后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但仍顯著低于正常組（P ＜0.05）

2.5 **后各組小鼠OR 基因表達(dá)水平比較 各組小鼠13個(gè)OR 基因檢測結(jié)果顯示，沒有經(jīng)過任何**的抑郁組小鼠中除MOR11 外，其余OR 基因表達(dá)水平均顯著低于正常組（P ＜0.05）。丁香組、莉組和蒸餾水組小鼠OR 基因表達(dá)水平則根據(jù)基因和芳香化合物的不同，與正常組差異不一樣。丁香組小鼠中MOR11、MOR124、MOR16、MOR378、MOR15、MOR744、MOR1 和MOR63 的基因表達(dá)水平顯著高于正常組（P ＜0.05），MOR544、MOR19 和MOR151 的基因表達(dá)水平則與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；與蒸餾水組比，丁香組小鼠除MOR151 和MOR1 的基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），其余OR 基因均顯著升高。莉組小鼠MOR744 和MOR1 基因表達(dá)水平顯著高于正常組，MOR11、MOR151、MOR63 與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），其余基因表達(dá)水平均顯著低于正常組（P ＜0.05）。莉組小鼠MOR11、MOR124、MOR19 和MOR378 基因表達(dá)水平與抑郁組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。莉組與蒸餾水組小鼠MOR15、MOR544、MOR744、MOR151、MOR1 基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。蒸餾水組小鼠MOR11、MOR744、MOR1、MOR63 基因表達(dá)水平顯著高于正常組，MOR124、MOR16、MOR378、MOR151與正常組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），MOR15、MOR19、MOR544 基因表達(dá)水平顯著低于正常組，但仍顯著性高于抑郁組（P ＜0.05）。見圖1-2。另外，在所有檢測的OR 基因中，只有MOR148 和MOR9 在經(jīng)過丁香精油和莉精油霧化**后基因表達(dá)水平仍顯著低于正常組。

3 討論

抑郁癥目前的**手段有抗抑郁****、心理**、物理**、中醫(yī)**等方法，其中，抗抑郁**是主要的**手段，但也存在不足之處，如**反應(yīng)較嚴(yán)重，易復(fù)發(fā)，服從性差，靶點(diǎn)單一等。中醫(yī)是我國醫(yī)療的特色，對(duì)抑郁癥的**也有獨(dú)特之處，例如針灸、藥膳、芳香療法等。相比針灸、藥膳，芳香物質(zhì)療法更方便、舒適、易于接受。芳香療法可通過口服、腸道、吸入及局部皮膚等給藥途徑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生作用，口服的方式吸收較快，但從**角度看，吸入和肌膚給藥較為**，而且方便控制劑量。芳香療法**抑郁癥需要嗅覺的參與，因此，OR 基因的表達(dá)水平高低對(duì)芳香**抑郁癥效果的評(píng)判具有重要的指標(biāo)性意義。

嗅覺是動(dòng)物感覺中*重要的本能感覺之一，由上千個(gè)基因超家族控制，特異性受體決定OR神經(jīng)元所識(shí)別的氣味分子嗅覺信息除了傳導(dǎo)至大腦皮層產(chǎn)生嗅覺外，也可傳至邊緣系統(tǒng)，參與行為、記憶、情緒等活動(dòng)，從而影響**及***功能。由于抑郁癥與嗅覺的關(guān)系密切，嗅球切除動(dòng)物模型被廣泛運(yùn)用于抗抑郁**的篩選。芳香氣味分子被吸入鼻腔，被鼻黏膜中的OR識(shí)別和結(jié)合，產(chǎn)生動(dòng)作電位，嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)至大腦皮層的嗅覺區(qū)，促進(jìn)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的釋放，然后經(jīng)由大腦**神經(jīng)發(fā)出指令，去調(diào)控和平衡植物神經(jīng)系統(tǒng)，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)定、放松、愉悅或興奮的效果。通過呼吸，植物的香味分子也可以進(jìn)入肺部，在肺部進(jìn)**體交換，再進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，達(dá)到相應(yīng)的療效。因此芳香物質(zhì)**法的效果與動(dòng)物嗅覺之間具有很重要的關(guān)系。為了研究芳香化合物對(duì)抑郁癥的**效果，建立小鼠抑郁模型至關(guān)重要。建立動(dòng)物抑郁模型的方法很多，如CUMS+孤養(yǎng)，行為絕望、社會(huì)應(yīng)激、電誘導(dǎo)、利血平拮抗以及糖皮質(zhì)**受體基因突變等，其中CUMS+孤養(yǎng)的小鼠抑郁癥建模方式不僅成功率高，模型可靠，而且能更好地模擬抑郁癥病征，可以用來探究病因、病理及測試**情況。這種建模方式30 年前由KATZ提出，迄今為止，已在許多研究中被成功運(yùn)用。采用CUMS+孤養(yǎng)方式成功造模后，與正常小鼠相比，患有抑郁癥的小鼠多個(gè)生理指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生顯著性變化，如體質(zhì)量下降、攝食量減少、敞箱實(shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)得分下降，糖水偏愛百分比下降等，還有懸尾不動(dòng)時(shí)間百分比及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比顯著上升。

本研究采用CUMS+孤養(yǎng)方式造模后，與正常小鼠相比，患有抑郁癥的小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，懸尾不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳時(shí)間延長，血清5-HT濃度降低等顯著性生理變化；與造模前相比除體質(zhì)量無明顯變化外，其余指標(biāo)均呈現(xiàn)相同趨勢(shì)的變化。這與以前的許多研究成果一致，表明抑郁癥模型造模成功。如楊春蕊采用CMUS+孤養(yǎng)的方法成功建立小鼠抑郁模型后，發(fā)現(xiàn)抑郁小鼠與造模前體質(zhì)量差異不大，但與相同周齡正常小鼠相比，體質(zhì)量有明顯下降；懸尾不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間也顯著延長。王艷梅也同樣通過CMUS+孤養(yǎng)的方式成功建立小鼠抑郁模型后，發(fā)現(xiàn)與造模前相比，懸尾不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加，血清5-HT濃度明顯下降。另外，有研究表明，選擇6～8周齡小鼠成功造模后，抑郁小鼠體質(zhì)量不僅與正常小鼠相比顯著下降，而且與造模前體質(zhì)量比也有顯著下降。而本研究結(jié)果表明，小鼠抑郁后的體質(zhì)量只顯著輕于相同周齡正常小鼠，與其造模前相比，卻無明顯變化。這可能與選取的小鼠周齡有關(guān)，我們選取的小鼠為成年期（8～12 周）小鼠。有研究表明，刺激年幼的動(dòng)物，會(huì)增加對(duì)抑郁的易感性。因此，選擇成年期小鼠可以保證小鼠各項(xiàng)指標(biāo)測試結(jié)果更加穩(wěn)定.

芳香療法具有代謝快、高滲透性、不滯留、**反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，容易透過血腦屏障，達(dá)到**效果，而且效果與西藥**相當(dāng)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)芳香物質(zhì)**抑郁癥進(jìn)行了大量的研究。早在2001年就有研究指出薰衣草香味可以緩解緊張情緒。2008 年，KIECOLT-GLASER等研究發(fā)現(xiàn)柑橘香味可以改善抑郁癥。2009 年，劉瑤等發(fā)現(xiàn)芳香療法與抗抑郁****療效相當(dāng)，且芳香療法對(duì)消化道的**反應(yīng)較抗抑郁**低。徐金勇等指出丁香吸入可緩解抑郁癥小鼠的抑郁行為。2010 年，牛利華等指出薰衣草吸入能有效改善抑郁癥小鼠的抑郁行為，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，BAGATTA等研究發(fā)現(xiàn)佛手柑精油可減輕焦慮癥狀并能調(diào)節(jié)情緒。2013年，王艷梅研究表明，香草醛可改善小鼠抑郁行為。張乃舒等指出芳香療法可作為輔助療法用來緩解產(chǎn)后抑郁癥患者。魏永鴿等通過按摩、涂抹、吸入等方式使用精油能有效地改善亞健康狀態(tài)。2017年LEE等指出芳香療法可以緩解抑郁癥狀，提高睡眠質(zhì)量，卻不影響生理參數(shù)如**因子等。國內(nèi)*新臨床研究表明芳香精油經(jīng)絡(luò)推拿對(duì)抑郁癥低動(dòng)力癥狀有較好的臨床療效。

由此可見，利用芳香物質(zhì)**抑郁癥一種行之有效的方法。本研究中抑郁癥小鼠在接受相應(yīng)**后，通過測定小鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)丁香精油霧化**法對(duì)抑郁癥具有確切療效，而莉精油霧化**法對(duì)抑郁癥療效較差。丁香精油霧化**可以緩解甚至**小鼠抑郁癥已在以前的研究中得到了驗(yàn)證。有研究發(fā)現(xiàn)莉花香可以改善人的情緒，且飲用莉花茶可以起到抗抑郁的功效，這與我們的研究結(jié)果不一致，可能是由于采用的**方法不同或者是**的對(duì)象不同所導(dǎo)致。