【摘 要】 目的 探討復方制劑參益**片改善記憶作用的藥效學及其作用機制。方法 采用水迷宮試驗、避暗實驗、跳臺實驗觀察空白對照組、陽性對照組、復方制劑參益**片高( 1. 607 g/kg) 、中( 0. 536 g/kg) 、低( 0. 269 g/kg) 劑量組對小鼠改善記憶的作用; 采用熒光法對小鼠腦內 5-羥色胺( 5-HT) 、多巴胺( DA) 、去甲腎上腺素( NE) 進行含量測定，初步研究復方制劑參益**片改善小鼠記憶的作用機制。結果 避暗試驗中劑量組、高劑量組小鼠的潛伏期明顯延長( P＜0. 05) ，錯誤次數(shù)、進入暗室的動物數(shù)也明顯減少( P＜0. 05) ; 水迷宮試驗高劑量、中劑量組小鼠 2 min 內到終點的動物明顯增加( P＜0. 05) ; 跳臺試驗潛伏期有明顯延長作用( P＜0. 05) ; 腦 5-HT、DA、NE 含量與空白組比較顯著增加。結論 復方制劑參益**片具有明顯改善記憶的功能，其機制可能與 5-HT、DA、NE 的相互調節(jié)有關。
〔關鍵詞〕 參益**片; 學習記憶; 5-羥色胺; 多巴胺; 去甲腎上腺素
參益**片是在參芪五味子片的基礎上，結合文獻報道按照中醫(yī)理論設計而成的**，由人參、五味子、酸棗仁、益智四種中藥材組成。人參和益智仁為益智**的常用藥，酸棗仁具有養(yǎng)心**、斂汗的功效，它不僅是****不寐之藥，還能滋補強壯，久服能養(yǎng)心健腦; 加用五味子，有酸斂收澀、**生津等功效，善治心腎兩經的虛虧或不調引起的心神不安、驚悸**等。但復方制劑是否具有明顯的改善記憶、**催眠的作用未見報道。本文主要對復方制劑參益**片改善記憶作用進行藥效學研究，并探討其作用機制。
1 材料與方法
1. 1 實驗藥品及試劑 復方制劑參益**片，自制。含生藥量 2 g/片( 所需藥材均購于長春市宏檢大藥房) ; 棗東**顆粒( 北京優(yōu)你特藥業(yè)有限公司) 批號: 130501; 實驗所需**均以蒸餾水配制所需濃度。酸性正丁醇、正庚烷、鄰苯二甲醛-鹽酸溶液、碘試液、半胱氨酸溶液、p H7. 2 的磷酸鹽緩沖液( PBS) 、乙二胺四乙酸( EDTA) 試液。
1. 2 動物 健康昆明鼠種( KM) ，18 ～ 22 g，雌雄各半，購于吉太小動物用品經銷處: 受試小鼠引進后置于長春中醫(yī)藥大學動物實驗室飼養(yǎng)。溫度: ( 20±3) ℃ ，相對濕度: 50% ～ 70% 。
1. 3 實驗儀器 AL 204 萬分之**平( 梅特勒-托利多儀器( 上海) 有限司) ; Cary Eclipse 分子熒光光度計( 鄭州中譜儀器設備有限公司) Ｒ205 恒溫水浴鍋( 上海申生科技有限公司) ;T18 basic 組織勻漿儀(廣州儀科實驗室技術有限 公司) ;KQ3200DB 數(shù)控超聲清洗器( 廣州儀科實驗室技術有限公司) ;XR-3TB型跳臺實驗儀器(上海欣軟信息科技有限公司) ;XR-XB110小鼠避暗實驗儀器(上海欣軟信息科技有限公司) ; Morris 水迷宮實驗系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) 。
1. 4 方法 將 50 只小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組、高劑量組( 1. 606 5 g/kg) 、中劑量組( 0. 535 5 g/kg) 、低劑量組( 0. 267 8 g/kg) ，3 個劑量組分別灌胃給藥參益**片，空白對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予棗東**顆粒，灌胃15 d 后，開始對各組小鼠進行訓練并測定。
1. 4. 1 跳臺試驗 分別將小鼠放在絕緣平臺上(通過Supersdt軟件實時記錄) 。記錄第 2 次跳下平臺的潛伏期、3 min 內的跳下平臺的錯誤次數(shù)和各組跳下臺的動物數(shù)。訓練 3 d 后開始測試。
1. 4. 2 避暗實驗 將小鼠置于電擊室，背對洞口，先給予條件刺激( 燈光) 15 s
，在亮燈 10 s 后開始通電 5 s( 電擊強度為0.2mA) 。記錄每只小鼠進入暗室的潛伏期、5 min 內進入暗室錯誤的次數(shù)和各組進入暗室的動物數(shù)。并計算 5 min內進入暗室( 錯誤反應) 的百分率，訓練 5 d 后開始測試。
1. 4. 3 水迷宮實驗 從訓練第 1 天開始，每批實驗各有 1 只小鼠給藥，平行操作，5 min 后再給**批小鼠注射，以此類推。每天訓練 4 次，每次隨機選擇一個入水點，觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間( 潛伏期)
。4 次訓練小鼠分別從 4 個不同的入水點入水，如果小鼠在 120 s 內未找到平臺，需將其引至平臺。這時潛伏期計為 120 s，每次訓練間隔60 s，以 4 次的平均時間及路程作為每天的訓練成績，連續(xù)訓練5 d后開始測定。
1. 4. 4 復方制劑參益**片片對小鼠腦內單胺類神經遞質去甲腎上腺素( NE) 、多巴胺( DA) 、5-羥色胺( 5-HT) 的影響。
1. 4. 4. 1 腦組織 NE 含量測定 上述實驗小鼠 50 只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，取左半腦組織加入2 ml酸性正丁 醇 后 勻 漿，2 500 r/min 離 心 5 min，分 別 取 上 清 液0. 4 ml，加正庚烷 0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml
超 聲1 min，2 500 r / min 離心 5 min 分別取底層水相。水相 50 μl，加PBS 150 μl加 EDTA 40 μl，加新配制的碘液 20 μl，混勻，靜置3 min，分別加堿性磷酸鈉40 μl，混勻，靜置 3 min，分別加醋酸40 μl，混勻，80℃
水浴 10 min，冷卻即得。吸取各樣品 200 μl 置96 孔板內，進行含量測定，激發(fā)波長 382 /488。
1. 4. 4. 2 腦組織中 DA 的含量測定 上述實驗小鼠 50 只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸 性 正 丁 醇 后 勻 漿，分 別 取 上 清 液 0. 4 ml，加 正 庚 烷0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml 超聲 1 min，2 500 r / min 離心5 min分別取底層水相。水相 50 μl，加 PBS 150 μl 加 EDTA40 μl，加新配制的碘液 20 μl，混勻，靜置 3 min，分別加堿性磷酸鈉
40 μl，混勻，靜置 3 min，分別加 5 mol/L 醋酸 40 μl，混勻，100℃ 水浴15 min，冷卻即得。精密吸取各樣品 200 μl 置 96 孔板內，進行含量測定，激發(fā)波長為 325 /385。記錄結果。
1. 4. 4. 3 腦組織中 5-HT 的含量測定 上述實驗小鼠 50 只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸 性 正 丁 醇 后 勻 漿，分 別 取 上 清 液0. 4 ml，加 正 庚 烷0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml 超聲 1 min，2 500 r / min 離心 5 min 分別取底層水相。取水相 0. 4 ml，加入 0. 25% 半胱氨酸( 新配) 0. 1 ml，再加入 0. 002% OPT-10 NHCl 3 ml?；靹?，沸水浴10 min，冷卻即得。精密吸取各樣品 200 μl 置 96 孔板內，進行含量測定，激發(fā)波長為 368 /480。
1. 5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS17. 0 統(tǒng)計軟件進行 t 檢驗。
2 結 果
2. 1 復方制劑參益**片跳臺實驗結果 陽性對照組、中劑量組潛伏期與錯誤次數(shù)與空白對照組比較顯著差異( P＜0. 05或 P＜0. 01) ，高劑量組潛伏期與錯誤次數(shù)與空白對照組比較有極顯著性差異( P＜0. 01) 。
2. 2 復方制劑參益**片避暗實驗結果 中劑量組錯誤次數(shù)與空白對照組比較有顯著差異( P＜0. 05) ，高劑量組、陽性對照組錯誤次數(shù)與空白對照組比較有極顯著性差異( P＜0. 01) ，其他4 組測試潛伏期與空白對照組比較均有增長。
2. 3 復方制劑參益**片水迷宮實驗結果 中劑量組、高劑量組實驗完成時間〔( 69. 84±23. 37) s、( 65. 45±22. 98) s〕與空白對照組〔( 114. 82±7.96) s〕比較差異顯著( P＜0. 05) 。陽性對照組為( 101. 72±26. 32) s，低劑量組為( 80. 50±27. 65) s。
2. 4 小鼠腦內單胺類神經遞質測定結果 高、中劑量組腦內 5-HT、DA、NE 含量與空白對照組比較顯著增加( P ＜0. 05) ，低劑量組與空白對照組比較均升高，但無顯著差異( P ＞0. 05) 。
3 討 論
參益**片選取了四味常用的中藥進行配伍，通過避暗試驗、跳臺試驗、水迷宮試驗可以看出無論是錯誤次數(shù)還是潛伏期給藥組都有所改善，其藥效與陽性對照藥對比藥效相當，因而從藥效學角度看來，參益**片的改善學習記憶作用可以得到較充分的肯定，有較好的益智作用。單胺類神經遞質包括兒茶胺和吲哚胺兩類，前者包括 DA、NE 和腎上腺素，后者為 5-HT，大腦皮質、紋狀體中存在大量的DA 和 5-HT 能神經末梢，他們對**活動如感情、學習、記憶起重要作用
。DA 含量下降是腦功能衰老的表現(xiàn)之一，學習記憶增強常伴有 NE、DA 的增加但對 5-HT 的報道還不是特別明確。參益**片片改善小鼠學習記憶能力可能與 5-HT、DA、NE的相互調節(jié)有關。相關文獻報道，神經**內的 DA 代謝會影響 NE
的代謝，NE 可能調節(jié)廣泛腦區(qū)的突觸傳入活動，增大環(huán)境中有意義的信息傳入，而抑制其他傳入刺激的干擾，從而提高注意力，增強學習能力。
本實驗采用熒光法對神經遞質的含量進行測定用于研究改善記憶的作用機制，熒光法與液相色譜法進行比較，熒光法實驗能提高實驗效率，目前試劑盒的應用也越來越廣泛，可以在后續(xù)的機制研究試驗中進行優(yōu)選。
