〔摘 要〕 目的 觀察血管性癡呆( VD) 大鼠在長久性雙側頸總動脈阻斷術后行為學改變、 海馬 CA1 區(qū)病理變化及神經元 5 -HT6 受體表達的變化。 方法 采用長久性雙側頸總動脈阻斷模擬慢性腦缺血所致 VD， 在術后 4 w 和 8 w 進行 Morris 水迷宮實驗評估假手術組和 VD 組大鼠的空間學習和記憶能力， 對術后 2 d、1 w、4 w、8 w 的腦組織進行組織病理學檢查( HE 染色、 Nissl 染色) 及**組織化學檢測海馬 CA1 區(qū)神經元 5 -HT6 受體的表達。 結果 術后 4、8 w VD 大鼠在定位航行試驗中的平均潛伏期是(87. 69 ± 7. 34) s、 (103. 77 ± 11. 18 ) s， 較同時間假手術組〔(48. 62 ± 7. 97 ) s、(36. 38 ± 17. 08) s〕 明顯延長， 而空間探索試驗中 VD 大鼠在目標象限的平均搜尋時間是 ( 16. 55 ± 3. 93 ) s、 ( 12. 66 ± 3. 30) s， 較假手術組〔( 27. 86 ±3. 16) s、(24. 37 ± 3. 75) s〕 明顯縮短。 VD 大鼠海馬 CA1 區(qū)神經元缺血性變性、 壞死隨缺血時間延長逐漸加重， 在術后 2 d、 1 w、 4 w、 8 w， VD 組海馬
CA1 區(qū)錐體神經元數目分別為 23 ± 2、17 ± 2、13 ± 2、5 ± 2， 而假手術組分別為 25 ± 2、26 ± 2、25 ± 2、27 ± 2。 **組化顯示海馬 CA1 區(qū)神經元 5 -HT6 受體在雙側頸總動脈阻斷術后 1 w 表達開始減少， 術后 4 ～ 8 w 表達明顯減少。 結論 雙側頸總動脈阻斷所致的 VD 大鼠出現明顯學習 、 記憶功能障礙， 海馬 CA1 區(qū) 5 -HT6 受體表達隨慢性腦缺血持續(xù)而下降， 該受體的表達下調可能與缺血性腦損傷所致的認知功能障礙有關。

〔關鍵詞〕 血管性癡呆; 海馬; 5 -HT6 受體; 認知障礙

腦血管病， 尤其是腦卒中后慢性腦缺血被認為是血管性癡呆( VD) 的*常見病因 ， 其病理生理機制涉及缺血后繼發(fā)的腦能量代謝障礙、 炎癥因子的瀑布效應、 氧化應激損傷、 興奮性氨基酸毒性作用、 膽堿能神經元功能缺失等〔 1〕 。 5 -羥色胺( 5 -HT)受體家族在**神經系統(tǒng)認知、 情感、 攝食、 晝夜周期等生理活動中具有調節(jié)作用〔 2〕 ， 其中 ， 5 -HT6 受體幾乎僅分布在中 樞神
經系統(tǒng)， 尤其以紋狀體、 皮層、 邊緣系統(tǒng)等腦區(qū)的分布密度高，已被證實參與大腦學習 、 記憶、 情感等**智能和精神活動〔 3〕 。本文采用大鼠長久性雙側頸總動脈阻斷模型， 觀察腦缺血后海馬病理變化及 CA1 區(qū) 5 -HT6 表達的改變， 探討該受體與 VD 發(fā)病的相關性。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物 健康 SPF 級 Wistar 大鼠 80 只 ， 購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心， 體重 200 ～ 250 g， 雌雄比例為 1 ∶ 1 ， 所有實驗大鼠飼養(yǎng)于廣州**廣州總醫(yī)院動物中心， 飼養(yǎng)房內溫度( 22 ± 3) ℃ ， 濕度 60% ， 5 只 /籠， 光 /暗周期為 12 h /12 h， 實驗期間自由獲取水及標準顆粒飼料。
1. 1. 2 主要試劑 兔抗鼠5-HT6 受體多克隆抗體購自 Abcam 公司， Envision 二步法檢測試劑盒購自 Dako 公司， 二氨基聯苯胺(DAB) 試劑購自福州邁新生物公司， 其余化學試劑均為分析純級 。
1. 1. 3 主要儀器 Morris 大鼠水迷宮， SuperMaze 動物行為學視頻分析系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) ， 日本 Olympus BX-51 顯微鏡， ImagePro plus 病理圖文分析系統(tǒng) 。
1. 2 方法
1. 2. 1 動物分組及模型制作 所有大鼠適應性飼養(yǎng) 1 w 后隨機分成兩組， VD 組 50 只 ， 假手術組 ( SO 組) 30 只 。 動物術前禁食 、 禁水 4 h， 稱重后以 10% 水合氯醛按 350 mg/kg 體重腹腔注射麻醉， 將大鼠仰臥位固定后常規(guī)**頸部手術區(qū)域， 在頸前正中作一長約 1 cm 的縱形切口 ， 鈍性分離皮下軟組織 、 頸前肌群， 在氣管的側后方找到頸動脈鞘， 分離頸總動脈與迷走神經， 以 1 號絲線長久性結扎頸總動脈， 同法結扎另一側頸總動脈， 局部**后恢復組織層次并縫合皮膚 。 SO 組大鼠除不結扎雙側頸總動脈外， 其余操作與 VD 組大鼠一致 。 術后動物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)， 自由獲取水源及飼料 。
1. 2. 2 動物行為學觀察(Morris 水迷宮實驗) 大鼠 Morris 水迷宮為一內徑 160 cm、 高 50 cm 的圓形水池， 水池內壁被漆成黑色， 池壁上黏貼不同形狀的空間標記物， 一個直徑為 12 cm的逃生平臺固定于水池中的某一象限( 即目標象限) ， 進水后水面高出平臺約 1 cm， 水池上方橫架安裝連接計算機顯示系統(tǒng)的攝像儀。
SO 組和 VD 組大鼠分別在雙側頸總動 脈阻斷術后 4、8 w進行 Morris 水迷宮實驗， 第 1 ～ 4 天( 即 trial 1、trial 2、trial 3、trial 4) 將大鼠從四個不同象限面向水池壁放入水中 ， 大鼠找到逃生平臺后終止信息采集， *長采集時間為 120 s， 若超過 120 s大鼠仍未能找到平臺， 則將其引導至逃生平臺并在平臺上站立20 s 以使其形成對空間參照物的記憶， 每只大鼠如此訓練 4次 /d， 每次訓練之間有 15 s 間歇以便休息， 連續(xù)訓練 4 d， 記錄大鼠找到平臺的逃避潛伏期評估其空間學習能力 ; 第 5 天將逃生平臺從水池中 撤去， 將大鼠從四個不同象限投入水中 ， 記錄60 s 內大鼠在目標象限搜尋的時間 ， 以此評估大鼠的空間記憶能力。 每天固定在 8: 00 ～ 17: 00 進行水迷宮實驗， 實驗過程中保持房間內光照恒定并且無光線直射于水面， 水溫控制在 26℃左右， 迷宮外參照物保持不變。
1. 2. 3 組織標本固定、 制片、 染色 每組各取 5 ～ 6 只大鼠分別在術后的相應觀察終點麻醉動物， 以 4℃ 預冷 4% 多聚甲醛溶液經心臟灌注固定， 斷頭取腦后從視交叉后 2 ～ 3 mm 處冠狀位切取厚度約 3 mm 的腦組織， 放入 10% 中性甲醛溶液中固定24 h。 在自動脫水機中梯度酒精脫水、 透明、 浸蠟后包埋， 蠟塊組織作連續(xù)冠狀切片， 厚度 2 ～ 3 μm。 石蠟切片脫蠟、 水化后分別進行蘇木素-伊紅 ( HE) 染色和 Nissl 染色， 在光學顯微鏡高倍鏡( × 400) 下觀察海馬 CA1 區(qū)錐體細胞計數及形態(tài)。
1. 2. 4 **組化顯色分析海馬 CA1 區(qū) 5-HT6 受體的分布與表達 石蠟切片經脫蠟、 水化， 置于 pH6. 0 的檸檬酸鹽中高壓修復; 0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次， 3% 過氧化氫溶液避光孵育 10 min 以 阻 斷 內 源 性 過 氧 化 物 酶， 0. 01 mol /L PBS 沖 洗5 min × 3 次， 切片滴加兔抗鼠 5-HT6 受體多克隆抗體(1 ∶ 1 000稀釋 ) ， 置 于 濕 盒 內 4℃ 冰 箱 中 過 夜 孵 育; 次 晨 取 出 切 片0. 01 mol /L PBS 沖洗 5 min × 3 次， 滴加葡聚糖復合物( 二抗) ，室溫下孵育 40 min， 0. 01 mol /L PBS 沖洗 5 min × 3 次， 滴加DAB 顯色， 顯微鏡下觀察顯色合適后流水沖洗終止反應， 梯度酒精脫水、TO 生物透明劑透明 ， 中性樹膠封片后鏡檢觀察。
1. 3 統(tǒng)計學方法 應用 SPSS13. 0 軟件進行分析， 計量資料采用 x ± s 表示， 兩組獨立樣本均數比較采用 t 檢驗， 多個樣本均數比較進行 Levene 方差齊性檢驗， 方差齊采用單向方差分析， 方差不齊采用 Brown-Forsythe 法; 平均逃避潛伏期和平均游泳速度在滿足 Mauchly 球對稱檢驗時采用單個重復測量因素的方差分析，不滿足 Mauchly 球對稱檢驗經 Huynh-Feldt 系數校正自由度。
2 結 果
2. 1 大鼠 Morris 水迷宮結果 術后 4、8 w， SO 組和 VD 組大鼠在定位航行試驗中的平均游泳速度均無明顯統(tǒng)計學差異( P ＞ 0. 05) 。 術后 4 w 和 8 w， VD 組大鼠與同時間點 SO 組大鼠平均逃避潛伏期比較均明顯延長( P ＜0.001 ) ， 提示 VD 組大鼠在術后無明顯運動功能障礙， 但存在空間學習能力減退， 而且學習能力下降隨腦缺血時間延長加重術后 4 w 空間探索試驗中 ， SO 組和 VD 組大鼠目標象限的平均搜尋時間比較具有統(tǒng)計學差異( P ＜ 0.001 ) ， 提示 VD 組大鼠空間記憶能力下降。
見表 1 ， 表 2， 圖 1。

2. 2 VD 大鼠海馬 CA1 區(qū)組織病理學改變 HE 染色后在高倍鏡( × 400) 下， 假手術組大鼠海馬 CA1 區(qū)神經元排列整齊 、 緊密， 胞膜完整， 胞核清楚; 術后 2 d VD 組海馬 CA1 區(qū)未見明顯的病理變化， 錐體細胞數量略減少; 術后 1 w VD 組海馬 CA1 區(qū)神經元排列基本正常， 但錐體神經元數量減少; 術后 4 w VD 組CA1 區(qū)神經元排列稀疏 、 紊亂， 錐體細胞變性壞死 、 數量明顯減少， 胞核固縮， 胞漿嗜酸性; 術后 8 w VaD 組海馬病理改變進一步加重， 神經元細胞空泡化， 錐體細胞基本消失 。 見圖 2。
尼氏染色后在高倍鏡 ( × 400) 下， 假手術組大鼠海馬 CA1區(qū)錐體神經元胞質中尼氏體豐富呈斑片狀; 術后 2 d VD 組大鼠海馬 CA1 區(qū)錐體神經元形態(tài)結構基本正常， 神經元尼氏體未見減少; 術后 1 w VD 組海馬 CA1 區(qū)錐體神經元空泡化改變， 胞漿內尼氏體減少; 術后 4 w， VaD 組海馬 CA1 區(qū)錐體神經元固縮，細胞數明顯減少; 術后 8 w， VD 組海馬 CA1 區(qū)錐體神經元排列稀疏、 紊亂， 胞漿中尼氏體顯著減少。 見圖 3， 圖 4。
2. 3 **組化分析海馬 CA1 區(qū)神經元 5-HT6 受體表達變化與假手術組大鼠比較， VD 組大鼠海馬 CA1 區(qū)神經元 5-HT6 受體在術后 2 d 無明顯變化， 術后 1 w 表達略減少， 在術后 4 ～ 8 w亞組中表達明顯減少( P ＜ 0. 001 )。見圖 5， 表 3。

3 討 論
VD 是各種腦血管因素相關病因所致腦血流循環(huán)障礙并引起與認知相關腦區(qū)神經元退行性改變 、 全腦功能退化的神經退行性** 。 本文采用大鼠雙側頸總 動脈阻斷模型模擬人類因慢性腦缺血 、 全腦低灌注所致的 VD， 該模型引起典型的皮層缺血性改變和皮層下白質病變， 包括白質疏松化 、 脫髓鞘 、 膠質增
生等， 與人類老齡化或腦卒中后癡呆的神經病理改變相似， 是VD 的經典動物模型〔 4 〕 。 Farkas 等〔 5〕 指出大鼠長久性雙側頸總動脈阻斷模型術后腦血流的減少是有選擇性的， 以皮層和白質腦血流下降*為明顯， 僅為正常大鼠的 35% ～ 45% ， 海馬腦血流下降到正常大鼠的 60% 左右， 術后 1 w 腦血流開始恢復， 但4 w以后腦血流仍明顯低于正常對照的動物， 術后 8 ～ 12 w 腦血流基本恢復到正常水平。 本實驗觀察發(fā)現缺血急性期海馬損傷并不十分明顯， 術后 1 ～ 2 w 可以在海馬觀察到 CA1 區(qū)錐體神經元丟失、 膠質細胞激活， 并且這種缺血性損害隨著腦缺血狀態(tài)的持續(xù)而進行性加重， 術后 4 w 海馬 CA1 區(qū)錐體神經元明顯減少， 神經元空泡樣變性， 術后 8 w 海馬病變呈毀滅性， 錐體細胞顯著減少， 這與文獻報道的結果一致〔 6〕 。 雖然慢性缺血過程中腦血流通過側支循環(huán)重建等各種代償機制使全腦血流在8 ～ 12 w 后逐漸恢復到正常水平， 但低灌注對海馬造成的缺血性損害是不可逆的。 實驗中術后 8 w VD 組大鼠在定位航行試驗中逃避潛伏期較假手術對照組明顯延長， 空間探索試驗中在目標象限的搜尋時間亦較假手術組減少， 均提示海馬缺血性損傷對 VD 大鼠造成的空間學習 、 記憶能力減退的影響。 一方面，海馬作為腦內 參與學習 、 記憶等**智能活動的重要腦區(qū)， 因其特殊的供血結構而對缺血極為敏感， 另一方面， 錐體神經元長時程增強( LTP) 是記憶形成的重要神經生理基礎， 推測海馬慢性缺血性損傷、 錐體神經元丟失參與了 VD 的發(fā)病機制。
目前， 已發(fā)現 5-HT 受體家族包括七種分型 (5-HT1 ～ 7 R) ，5-HT1 A、5-HT4 和 5-HT6 受體是在多項動物實驗研究中被發(fā)現與**神經系統(tǒng)認知、 學習、 記憶等思維活動密切相關的受體亞型〔 7〕 ， 其中 ， 5-HT6 受體幾乎僅分布于**神經系統(tǒng)， 而且其所分布的腦區(qū)均與人類的認知、 學習、 記憶、 情感等功能相關，在腦內與乙酰膽堿、 谷氨酸、 γ-氨基丁酸、 腎上腺素、 去甲腎上腺素等多種參與學習 、 記憶、 情感、 認知過程的神經遞質均有相互作用〔 3〕 。 在與學習、 記憶密切相關的海馬， 5-HT6 受體主要分布在 CA1 區(qū)神經元突觸后膜上。 基于雙側頸總動脈阻斷后腦血流的動態(tài)改變及海馬缺血性損傷的時間特點， 實驗中選擇了術后 2 d、1 w、 4 w、 8 w 作為 5-HT6 受體表達水平的觀察時間點。行為學觀察結果證實 VD 大鼠存在明顯空間學習 、 記憶能力缺失， 且這種學習 、 記憶能力的減退隨腦缺血時間延長加重。 結合**組化結果分析， VD 大鼠海馬 CA1 區(qū)神經元上 5-HT6 受體的表達在腦缺血術后 1 w 開始下降， 以術后 4 ～ 8 w 受體表達下調*為顯著， 5-HT6 受體表達的下調與動物學習 、 記憶功能下降的時間基本一致。 基于 Morris 水迷宮是海馬依賴性的行為學檢測方法， 因此推測 VD 大鼠空間學習 、 記憶能力減退與神經元 5-HT6 受體表達改變相關。 一方面， 考慮到慢性缺血對海馬所造成的組織病理學改變， 尤其是錐體神經元的變性壞死、 丟失， 可能導致受體蛋白表達、 合成減少; 另一方面， 國外研究證實拮抗 5-HT6 受體可以促進腦內乙酰膽堿釋放〔 8， 9〕 ， 后者是記憶形成與維持的重要神經遞質 ， 而且動物行為學研究 發(fā)現 5-HT6 受體拮抗劑能提高學習 、 記憶、 改善認知功能 〔 10〕 并可以逆轉由抗膽堿能**( 如東莨菪堿) 所致的記憶缺損， 因此， 可以推測慢性腦缺血后期 5-HT6 受體表達下調可能是**神經對抗缺血性損傷的一種保護機制， 通過受體表達下調重新調節(jié)神經信息網絡中其他神經遞質 ， 如乙酰膽堿、 谷氨酸等的水平， 從而提高**神經對缺血性腦損傷后認知功能障礙的耐受性。
綜上所述， 海馬是高等動物學習 、 記憶過程中重要的信息整合**， 5-HT6 受體表達于海馬 CA1 區(qū)神經元， 拮抗該受體可以提高海馬中乙酰膽堿的水平， 在發(fā)生慢性腦缺血后上述區(qū)域該受體表達隨缺血進展而減少可能是**神經信息網絡重構的一種代償機制。