摘要：目的 觀察消栓腸溶膠囊對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠新異性探索行為以及海馬微管相關(guān)蛋白２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?。穑颍铮簦澹椋睢。?，ＭＡＰ－２）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ｂｒａｉｎ?。洌澹颍椋觯澹洹。睿澹酰颍铮簦颍铮穑瑁椋恪。妫幔悖簦铮?，ＢＤＮＦ）、β淀粉樣蛋白－４２（β－ａｍｙｌｏｉｄ－４２，Ａβ４２）表達(dá)的影響。方法　采用線栓法建立大鼠中動(dòng)脈栓塞模型。將９０只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、消栓腸溶膠囊組（再按體質(zhì)量４２０、１４０、４７ｍｇ／ｋｇ分３個(gè)劑量亞組）、腦心通膠囊組（陽(yáng)**物組），連續(xù)灌胃給藥１５ｄ，１次／ｄ。在造模第１５天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；采用**熒光染色法檢測(cè)海馬ＭＡＰ－２和ＢＤＮＦ的表達(dá)；**組化法檢測(cè)海馬Ａβ４２的表達(dá)。結(jié)果 模型組大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)、邊緣區(qū)（四個(gè)角及四個(gè)邊）的活動(dòng)路程減少；經(jīng)消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ**后，大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)總路程及邊緣區(qū)活動(dòng)路程較模型組明顯增加（Ｐ＜０．０５）。和假手術(shù)組相比，模型大鼠海馬ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ表達(dá)下調(diào)，Ａβ４２表達(dá)增強(qiáng)（均Ｐ＜０．０５）；與模型組比較，消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ**組大鼠海馬ＭＡＰ－２表達(dá)明顯增強(qiáng)（Ｐ＜０．０５），消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ**組大鼠海馬ＢＤＮＦ表達(dá)升高，Ａβ４２表達(dá)降低（均Ｐ＜０．０５）。結(jié)論 消栓腸溶膠囊可提高腦缺血大鼠在新異性環(huán)境中的探索能力，并通過(guò)提高內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，抑制Ａβ４２異常聚集，減少神經(jīng)元損害，增強(qiáng)海馬神經(jīng)元樹(shù)突的可塑性。

關(guān)鍵詞：消栓腸溶膠囊；腦缺血；曠場(chǎng)；微管相關(guān)蛋白２；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；β淀粉樣蛋白－４２　　

腦卒中后，患者不僅出現(xiàn)軀體殘疾，還可出現(xiàn)認(rèn)知功能減退、情緒低落、興趣喪失、注意力下降、睡眠障礙、焦慮易激惹多種神經(jīng)精神癥狀。補(bǔ)陽(yáng)還五湯為清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立的**缺血性卒中后遺癥的中藥復(fù)方，對(duì)腦梗死引發(fā)的肢體功能障礙、認(rèn)知障礙具有獨(dú)特的臨床療效。消栓腸溶膠囊是以補(bǔ)陽(yáng)還五湯為組方的國(guó)家中藥保護(hù)品種，膠囊劑型解決了湯劑煎煮、攜帶不便的問(wèn)題，同時(shí)藥品質(zhì)量可控，更好地適應(yīng)了臨床需要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察中動(dòng)脈栓塞大鼠探索新異環(huán)境的行為變化，評(píng)價(jià)消栓腸溶膠囊對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)精神癥狀的影響，并探討海馬微管相關(guān)蛋白２（ｍｉｃｒｏ－ｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?。穑颍铮簦澹椋睢。玻停粒校玻?、腦源性神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng) 因 子 （ｂｒａｉｎ?。洌澹颍椋觯澹洹。睿澹酰颍铮簦颍铮穑瑁椋恪。妫幔悖簦铮颍拢模危疲?、β淀粉樣蛋白－４２（β－ａｍｙｌｏｉｄ－４２，Ａβ４２）的表達(dá)及其作用機(jī)制，為腦卒中患者的康復(fù)**提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

１　材料和方法

１．１　實(shí)驗(yàn)材料

?。樱校萍?jí)雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠９０只，體質(zhì)量３００～３５０ｇ

，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng) 物 合 格 證 號(hào)：ＳＣＸＫ（京）２０１２－０００１。飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心ＳＰＦ級(jí)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證號(hào)：ＳＹＸＫ（ＪＩＮＧ）２０１０－００２０。將大鼠隨機(jī)分為６組：假手術(shù)組、模型組、消栓腸溶膠囊３個(gè)劑量組（４２０、１４０、４７ｍｇ／ｋｇ）和陽(yáng)性對(duì)照組（腦心通膠囊６００ｍｇ／ｋｇ），每組１５只大鼠。大鼠新異性探索行為及樹(shù)突重塑的影響機(jī)制

１．２　主要試劑和儀器

　包括消栓腸溶膠囊（三門(mén)峽賽諾維制藥有限公司），ＭＡＰ－２、Ａβ４２、ＢＤＮＦ（ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ公司），腦心通膠囊（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司），山羊抗兔ｌｇＧ／ＤｙｌｉｇｈｔＴＭ４８８、山羊抗兔ｌｇＧ／Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４、兔超敏二步法檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋公司），栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司），Ｅｃｌｉｐｓｅ生物顯微鏡、圖像采集分析系統(tǒng)（Ｎｉｋｏｎ公司），大鼠自發(fā)活動(dòng)分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）。

１．３　方法

?。保常薄〈笫笾袆?dòng)脈栓塞模型制備：線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞長(zhǎng)久性缺血模型。大鼠麻醉后，仰臥位固定，將栓線（直徑０．２６５ｍｍ，長(zhǎng)４ｃｍ）置于頸內(nèi)動(dòng)脈１８ｍｍ處，扎緊動(dòng)脈殘端，縫合皮膚。假手術(shù)大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分支，不閉塞大腦中動(dòng)脈。術(shù)中、術(shù)后室溫控制在２４～２５℃之間，大鼠體溫維持在３６．５～３７．５℃之間。大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)不能完全伸展左前肢、行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈者納為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。*終模型組１０只，消栓腸溶膠囊３個(gè)劑量組（４２０、１４０、４７ｍｇ／ｋｇ）分別為９只、９只、１２只，腦心通膠囊組８只，假手術(shù)組隨機(jī)選?。钢挥糜趯?shí)驗(yàn)。

１．３．２　給藥：根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體臨床等效劑量換算關(guān)系確定消栓腸溶膠囊的給藥劑量。消栓腸溶膠囊的臨床用量為１．２ｇ／ｄ，即２０ｍｇ／ｋｇ（按６０ｋｇ／人折算），消栓腸溶膠囊大鼠用劑量１４０ｍｇ／ｋｇ（相當(dāng)于臨床用劑量的７倍），４２０ｍｇ／ｋｇ（相當(dāng)于臨床用劑量的２１倍），４７ｍｇ／ｋｇ（相當(dāng)于臨床用劑量的３倍）。手術(shù)造模２ｈ后各干預(yù)組給藥１次，造模２４ｈ后再次灌胃給藥，連續(xù)給藥１５ｄ，每天１次。假手術(shù)組、模型組灌胃等容量生理鹽水。

１．３．３　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：大鼠中動(dòng)脈栓塞第１５天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在１個(gè)５４０ｃｍ×５９０ｃｍ×６９０ｃｍ的封閉箱中進(jìn)行，箱子頂部中央安置有攝像機(jī)，將大鼠放置在箱子中心處，讓其自由活動(dòng)５ｍｉｎ。采用自發(fā)活動(dòng)分析系統(tǒng)記錄并分析大鼠活動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)活動(dòng)路程、四個(gè)角及四個(gè)邊的活動(dòng)路程。大鼠新異性探索行為及樹(shù)突重塑的影響機(jī)制

１．３．４　取材與標(biāo)本處理：動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)?。粗淮笫舐樽?，４％（質(zhì)量濃度）多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，恒定灌注時(shí)間６０ｍｉｎ，待固定充分，開(kāi)顱取腦，將腦組織置大鼠腦模具固定，參照大鼠腦立體定位圖譜，切取視交叉后４ｍｍ組織塊，投入相同固定液于４℃固定１周后，常規(guī)石蠟包埋、切片。

１．３．５?。停粒校?、ＢＤＮＦ**熒光染色：腦組織切片經(jīng)檸檬酸緩沖液（ｐＨ６．０）高熱修復(fù)２０ｍｉｎ；１０％（體積分?jǐn)?shù)）羊血清封閉１ｈ；經(jīng)兔抗ＭＡＰ－２（１∶７００）、ＢＤＮＦ（１∶１００）４℃孵育４０ｈ，每片滴加山羊抗兔（１∶８００），室溫孵育２ｈ后，０．０１ｍｏｌ／Ｌ?。校拢酉礈?，ＤＡＰＩ封片。在激發(fā)／發(fā)射波長(zhǎng)４７０／４９０ｎｍ?xiàng)l件下，ＭＡＰ－２陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。在激發(fā)／發(fā)射波長(zhǎng)５４０／５８０ｎｍ?xiàng)l件下，ＢＤＮＦ陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。

１．３．６?。?/span>β４２**組織化學(xué)染色：腦組織切片經(jīng)檸檬酸緩沖液（ｐＨ６．０）微波修復(fù)２０ｍｉｎ；１０％（體積分?jǐn)?shù)）羊血清封閉１ｈ；經(jīng)兔抗Ａβ４２（１∶５０）４℃孵育４０ｈ后，二抗試劑１孵育３０ｍｉｎ，試劑２孵育１ｈ；ＤＡＢ試劑顯色９０ｓ，中性樹(shù)膠封片。

１．３．７　圖像采集與分析：在Ｏｌｙｍｐｕｓ光學(xué)顯微鏡下觀察**染色切片，采集每張切片缺血側(cè)（右側(cè)）海馬ＣＡ１區(qū)相互不重疊的３個(gè)視野，采用ＮＩＳ－Ｅｌ－ｅｍｅｎｔｓ?。拢幔螅椋恪。遥澹螅澹幔颍悖鑸D像分析系統(tǒng)對(duì)ＢＤＮＦ、ＭＡＰ－２和Ａβ４２陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行分析，以積分吸光度（ＩＯＤ，ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｏｐｔｉｃａｌ?。洌澹睿螅椋簦┓从酬?yáng)性表達(dá)的**強(qiáng)度。

１．４　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　采用ＳＰＳＳ１１．５統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用ＬＳＤ檢驗(yàn)。以Ｐ＜０．０５為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

２　結(jié)果

２．１　各組大鼠曠場(chǎng)行為學(xué)比較

　模型組大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)減少，在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)、邊緣區(qū)（四個(gè)角及四個(gè)邊）活動(dòng)路程以及活動(dòng)總路程均明顯少于假手術(shù)組（Ｐ＜０．０５）；經(jīng)消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ、腦心通膠囊干預(yù)后，大鼠在曠場(chǎng)活動(dòng)路程增加，特別是四個(gè)角及四個(gè)邊的活動(dòng)路程顯著大于模型組（Ｐ＜０．０５）（表１）。

２．２　各組大鼠腦組織ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ和Ａβ４２的表達(dá)  具體結(jié)果見(jiàn)表２、圖１～３。假手術(shù)組大鼠海馬結(jié)構(gòu)ＣＡ１－３區(qū)輻射層和腔隙層內(nèi)可見(jiàn)密集、叢狀的ＭＡＰ－２陽(yáng)性神經(jīng)元突起，即樹(shù)突；Ａβ４２陽(yáng)性表達(dá)主要位于神經(jīng)元核周體及周?chē)妮S突部位。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬ＣＡ１區(qū)ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減弱，Ａβ４２陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)（均Ｐ＜０．０５）。與模型組比較，消栓腸溶膠囊中劑量組（１４０ｍｇ／ｋｇ）大鼠海馬區(qū)ＭＡＰ－２陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)（Ｐ＜０．０５），消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ、４?。罚恚纾耄缂?nbsp;腦 心 通 膠 囊 組 大 鼠 海 馬ＢＤＮＦ陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)，而Ａβ４２表達(dá)明顯下調(diào)（均Ｐ＜０．０５）。

３　討論

　　新異性探索行為是動(dòng)物對(duì)新環(huán)境新刺激表現(xiàn)出的興奮行為，體現(xiàn)了動(dòng)物對(duì)新行為的獲得與發(fā)展、保持與再現(xiàn)的應(yīng)激能力，屬于學(xué)習(xí)記憶過(guò)程。曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)是比較經(jīng)典的動(dòng)物行為學(xué)指標(biāo)，能夠有效評(píng)價(jià)動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索、認(rèn)知能力以及伴隨的抑郁、焦慮、緊張等情緒變化。此研究結(jié)果顯示中動(dòng)脈栓塞１５ｄ模型組大鼠在曠場(chǎng)中央及周邊的活動(dòng)較假手術(shù)組明顯減少，表明腦缺血損傷可降低大鼠對(duì)新環(huán)境的探究興趣，減少動(dòng)物在新異環(huán)境中的探索行為。既往相關(guān)研究結(jié)果亦顯示，腦組織受損后，大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)路程減少，中央停留時(shí)間、跨格次數(shù)減少。這與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

　　海馬腦區(qū)與情緒、認(rèn)知關(guān)系密切，中動(dòng)脈栓塞后，不僅缺血中心區(qū)的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生明顯變化，在遠(yuǎn)離梗死區(qū)的海馬也發(fā)生病理性改變。ＭＡＰ－２為神經(jīng)元樹(shù)突重塑的標(biāo)志蛋白，對(duì)缺血損傷非常敏感，其活性下降可造成微管變性堆積，影響細(xì)胞骨架的完整，并可使線粒體的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙，*終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中動(dòng)脈栓塞１５ｄ模型大鼠海馬腦區(qū)ＭＡＰ－２表達(dá)較假手術(shù)組明顯減弱，結(jié)合模型組大鼠曠場(chǎng)探索行為的變化，提示局灶性腦缺血會(huì)損傷遠(yuǎn)隔腦區(qū)海馬樹(shù)突數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能，影響神經(jīng)元之間的信息傳遞，*終導(dǎo)致認(rèn)知功能損害及精神障礙。

　　補(bǔ)陽(yáng)還五湯為臨床上**缺血性腦中風(fēng)的有效復(fù)方。消栓腸溶膠囊為補(bǔ)陽(yáng)還五湯經(jīng)現(xiàn)代工藝技術(shù)制備而成的膠囊劑。該研究發(fā)現(xiàn)消栓腸溶膠囊可提高局灶性腦缺血大鼠在新異性環(huán)境中的探索能力，增強(qiáng)ＭＡＰ－２的**活性，提高海馬神經(jīng)元樹(shù)突可塑性。大鼠新異性探索行為及樹(shù)突重塑的影響機(jī)制

　　Ａβ、ＢＤＮＦ在神經(jīng)元損傷修復(fù)中的作用受到普通關(guān)注。Ａβ為β淀粉樣前體蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ?。穑颍澹悖酰颍螅铮颉。穑颍铮簦澹椋睿粒校校┑拇x產(chǎn)物。ＡＰＰ作為正常神經(jīng)元跨膜糖蛋白，由軸突的快軸漿運(yùn)輸通道運(yùn)輸，當(dāng)軸索損傷，ＡＰＰ異常聚集并經(jīng)淀粉樣降解途徑代謝后可產(chǎn)生Ａβ４２，Ａβ４２具有神經(jīng)毒性，可促發(fā)炎性反應(yīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，損傷軸突，導(dǎo)致突觸丟失。ＢＤＮＦ作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的一員，主要在神經(jīng)元合成，經(jīng)軸突運(yùn)輸，通過(guò)與其特異性膜受體酪氨酸激酶Ｂ（ｔｒｋＢ）結(jié)合，參與神經(jīng)元突觸的發(fā)育、存活、分化和軸突再生，在學(xué)習(xí)記憶中起重要調(diào)節(jié)作用。

　　本研究結(jié)果顯示，中動(dòng)脈栓塞后，大鼠海馬ＢＤＮＦ表達(dá)明顯下調(diào)，Ａβ４２**反應(yīng)增強(qiáng)，分析其原因可能為：腦缺血后，物質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)合成能力下降，神經(jīng)元細(xì)胞骨架崩潰，軸突運(yùn)輸障礙，因而內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子ＢＤＮＦ合成、分泌不足，同時(shí)由于Ａβ４２聚集和沉淀，觸及多種神經(jīng)毒性機(jī)制，干擾腦內(nèi)神經(jīng)元突觸間的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用而影響突觸的可塑性，影響學(xué)習(xí)記憶功能。

　　既往研究結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)改善局部腦血流量和細(xì)胞能量代謝、抗血栓形成、促進(jìn)軸索損傷后的修復(fù)，減輕神經(jīng)功能缺失，改善學(xué)習(xí)記憶功能。該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)消栓腸溶膠囊可明顯上調(diào)中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬腦區(qū)ＢＤＮＦ表達(dá)，降低Ａβ４２**陽(yáng)性反應(yīng)，提示消栓腸溶膠囊一方面可通過(guò)提高內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，保護(hù)受損神經(jīng)元；另一方面通過(guò)抑制Ａβ聚積和毒性作用，提高海馬神經(jīng)元樹(shù)突的可塑性，對(duì)改善腦梗后精神障礙具有積極的**意義。

　　該實(shí)驗(yàn)選擇腦心通膠囊為陽(yáng)**物對(duì)照，腦心通膠囊組方源于補(bǔ)陽(yáng)還五湯，是在補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上，增加水蛭、全蝎蟲(chóng)類(lèi)藥及丹參、當(dāng)歸、紅花等**化瘀中藥組成的現(xiàn)代中**劑，具有****、化瘀通絡(luò)之效，為臨床**缺血性中風(fēng)的常用中成藥。其有關(guān)藥理研究結(jié)果顯示，腦心通膠囊可降低血漿纖維蛋白原含量，抑制血小板聚集，改善微循環(huán)及能量代謝障礙，對(duì)抗谷氨酸、自由基毒性損傷，減少細(xì)胞凋亡。此研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腦心通膠囊**后大鼠在新異性環(huán)境中的探索能力明顯增強(qiáng)，海馬腦區(qū)ＢＤＮＦ表達(dá)增加，Ａβ４２**陽(yáng)性反應(yīng)下調(diào)，但ＭＡＰ－２表達(dá)較模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ組大鼠海馬ＭＡＰ－２表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng)。而ＭＡＰ－２參與胞漿蛋白運(yùn)輸和樹(shù)突生長(zhǎng)，是腦缺血缺氧后神經(jīng)細(xì)胞受損及再生的指標(biāo)之一。因此該研究結(jié)果提示，腦心通膠囊和消栓腸溶膠囊的作用環(huán)節(jié)可能并不完全一致，消栓腸溶膠囊促進(jìn)海馬樹(shù)突重塑的作用可能較腦心通膠囊更具優(yōu)勢(shì)，其機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。由于本研究?jī)H通過(guò)**熒光、**組化的方法觀察海馬腦區(qū)ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ、Ａβ４２的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)方法較單一，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)進(jìn)一步利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測(cè)技術(shù)對(duì)海馬ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ，Ａβ４２蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，通過(guò)多種技術(shù)手段和方法對(duì)消栓腸溶膠囊促進(jìn)腦功能康復(fù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。