摘要 目的：探討黃連**湯對(duì)衰老小鼠的抗衰老作用及其機(jī)制。方法：采用皮下注射Ｄ－半乳糖的方法制備衰老小鼠模型。將ＩＣＲ小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、１、２、４和８ｇ／ｋｇ黃連**湯生藥量處理組，采用自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的自主活動(dòng)，用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，用硫代***酸法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定腦組 織 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ＳＯＤ）和 丙 二 醛（ＭＤＡ）含量。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減退，ＭＤＡ含量增加，ＳＯＤ活性降低。黃連**湯各劑量組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，與１ｇ／ｋｇ和８ｇ／ｋｇ相比，２ｇ／ｋｇ和４ｇ／ｋｇ黃連**湯組小鼠腦內(nèi)的ＭＤＡ含量明顯降低，ＳＯＤ活性顯著增高。結(jié)論：黃連**湯能顯著改善Ｄ－半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與其抗氧化特性有關(guān)。黃連**湯對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶自發(fā)活動(dòng)的影響。
關(guān)鍵詞 黃連**湯；Ｄ－半乳糖；衰老；抗氧化
衰老是由多種復(fù)雜因素相互作用引起的生物學(xué)過(guò)程，是生命周期中按一定規(guī)律發(fā)生在機(jī)體、器官、組織細(xì)胞的形態(tài)和功能的演變過(guò)程。在動(dòng)物衰老模型中，由中國(guó)學(xué)者提出的利用大劑量Ｄ－半乳糖造成動(dòng)物的糖代謝障礙，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)代謝和脂類代謝，致使動(dòng)物組織、細(xì)胞出現(xiàn)一系列退行性變化，較為符合人類自然衰老時(shí)所出現(xiàn)的癥狀。
黃連**湯（ｈｕａｎｇｌｉａｎ－ｊｉａｎ－ｄｕ－ｔａｎｇ，ＨＪＤＴ）出自《外臺(tái)秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子４味生藥組成，為清熱**的經(jīng)典方劑。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界對(duì)ＨＪＤＴ的現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，應(yīng)用了大量的實(shí)驗(yàn)方法和動(dòng)物模型對(duì)其進(jìn)行了多方面的研究。結(jié)果表明，ＨＪＤＴ具有保護(hù)肝損傷及改善腦缺血等作用，在對(duì)ＡＰＰ／ＰＳ１雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病（ＡＤ）小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)ＨＪＤＴ可能通過(guò)提高抗氧化能力，對(duì)ＡＤ小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。但是，ＨＪＤＴ對(duì)Ｄ－半乳糖致衰老小鼠的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Ｄ－半乳糖致衰老模型，觀察ＨＪＤＴ對(duì)亞急性衰老小鼠的行為學(xué)以及腦組織中的超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和丙二醛（ＭＤＡ）含量的影響，進(jìn)一步為黃連**湯預(yù)防衰老作用提供科學(xué)依據(jù)。
１ 材料與方法
１．１ 藥品與試劑 Ｄ－半乳糖購(gòu)自ａｍｒｅｓｃｏ公司（批號(hào)：２０３２Ｃ１４９）。黃連**湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按３∶３∶２∶３比例混合，藥材購(gòu)自浙江省華東醫(yī)藥股份有限公司并經(jīng)鑒定，加水浸泡１ｈ，水煎２次，煎液濃縮至生藥含量為２ｇ／ｍＬ，ｐＨ?。罚??？捡R斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、ＳＯＤ（批號(hào)：２０１２１２２８）、ＭＤＡ（批號(hào)：２０１２１２３１）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。
１．２ 動(dòng)物與分組
ＩＣＲ小鼠９０只，雌雄各半，體重２３～２７ｇ，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：ＳＣＸＫ（滬）２００７－０００５］。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南，動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境（２２±２）℃下，１２ｈ明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、衰老模型組、ＨＪＤＴ?。薄ⅲ?、４和８ｇ／ｋｇ組，每組１５只。小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)１周后，采取頸背部皮下注射的方法，衰老模型組及各給藥組給予Ｄ－半乳糖溶液１５０ｍｇ／ｋｇ，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水，每日１次，連續(xù)１２周。其中后６周，ＨＪＤＴ各組增加灌胃給予ＨＪＤＴ?。?、２、４和８ｇ／ｋｇ。正常對(duì)照組和衰老模型組增加灌胃給予同等量生理鹽水，每日１次。
實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，先將小鼠放到自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境１ｈ。將小鼠頭朝前輕輕放入活動(dòng)箱中央，關(guān)上箱門(mén)，拍攝記錄自發(fā)活動(dòng)１ｈ。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用小鼠自發(fā)活動(dòng)計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，提取活動(dòng)軌跡及小鼠在開(kāi)場(chǎng)各區(qū)域的活動(dòng)路程、停留次數(shù)、停留時(shí)間等指標(biāo)。
１．４ 跳臺(tái)試驗(yàn)
小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)反射箱由不透明有機(jī)玻璃分隔為５間，箱底為銅柵，通以３６Ｖ電流，每間設(shè)置一高為３．０ｃｍ、直徑為３．２ｃｍ橡皮墊作為動(dòng)物回避電擊的**區(qū)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠置于箱中，自由活動(dòng)５ｍｉｎ，然后將其置于**臺(tái)上，箱底通電，觀察其跳臺(tái)的潛伏期（ｌａｔｅｎｃｙ，Ｌ）并記錄５ｍｉｎ內(nèi)小鼠跳下臺(tái)的次數(shù)，即錯(cuò)誤次數(shù)（ｍｉｓｔａｋｅ，Ｍ），此為訓(xùn)練成績(jī)，２４ｈ后再測(cè)為測(cè)試成績(jī)。
１．５?。樱希暮停停模恋壬笜?biāo)含量測(cè)定
小鼠腦組織用濾紙拭干后，精密稱重并盡快剪碎與冷生理鹽水按體積比１∶９混合，用勻漿器打勻后離心１０ｍｉｎ，分離出上清液即得１０％的組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定ＭＤＡ含量（硫代***酸法）。將１０％組織勻漿稀釋１０倍后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法分別測(cè)定ＳＯＤ活性（黃嘌呤氧化酶法）和蛋白含量（考馬斯亮藍(lán)顯色法）。黃連**湯對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶自發(fā)活動(dòng)的影響
１．６ 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ｘ±ｓ）表示，多組均數(shù)間比較采用Ｏｎｅ－ＡＮＯＶＡ檢驗(yàn)，兩兩比較采用Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ法。Ｐ＜０．０５表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
２ 結(jié)果
２．１?。龋剩模詫?duì)衰老小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響 與正常對(duì)照組相比，衰老模型組在總路程、中央路程和中央時(shí)間有減小的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表１，Ｐ＞０．０５）。ＨＪＤＴ各劑量組與衰老模型組相比也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表１，Ｐ＞０．０５）
２．２?。龋剩模詫?duì)衰老小鼠腦組織ＳＯＤ、ＭＤＡ含量的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組腦組織ＳＯＤ含量明顯降低，而ＭＤＡ含量顯著升高（圖１～２，Ｐ＜０．０１）。與衰老模型組相比，ＨＪＤＴ?。病ⅲ矗纾耄缃M腦組織ＳＯＤ含量顯著提高（圖１，Ｐ＜０．０５）、ＨＪＤＴ ２、４、８ｇ／ｋｇ組ＭＤＡ含量顯著降低（圖２，Ｐ＜０．０５）。
２．３?。龋剩模詫?duì)衰老小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組在跳臺(tái)試驗(yàn)的測(cè)試中，潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（圖３～４，Ｐ＜０．０１）。而ＨＪＤＴ?。?、２、４ｇ／ｋｇ能明顯延長(zhǎng)潛伏期（圖３，Ｐ＜０．０５），１、２、４、８ｇ／ｋｇ減少錯(cuò)誤次數(shù)（圖４，Ｐ＜０．０１）。
３ 討論
衰老是生命進(jìn)程中不可避免的生理功能的退化過(guò)程，這個(gè)過(guò)程包括認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)功能障礙等方面，在較短時(shí)間內(nèi)連續(xù)給動(dòng)物注射大劑量的Ｄ－半乳糖，在半乳糖氧化酶的作用下可以轉(zhuǎn)變成醛糖和氫過(guò)氧化物，從而導(dǎo)致過(guò)氧化物陰離子和氧自由基的大量生成和堆積，影響正常滲透壓，引起細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)損傷，學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，引起衰老。而腦衰老的特征表現(xiàn)為認(rèn)知功能和活動(dòng)能力等方面的行為缺陷，這與氧化損傷和炎癥密切相關(guān)，氧化性損傷成為衰老和其他與衰老相關(guān)的如ＡＤ、帕金森?。ǎ校模┑?*的關(guān)鍵。ＳＯＤ是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以通過(guò)歧化作用**超氧陰離子自由基，從而保護(hù)機(jī)體的細(xì)胞和組織，延緩衰老過(guò)程。但隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體**自由 基 的 能 力 下 降，產(chǎn) 生 大 量 代 謝 產(chǎn) 物 如ＭＤＡ，ＭＤＡ?xí)ㄟ^(guò)降低膜的流動(dòng)性以及改變膜結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能引起細(xì)胞膜的損傷，進(jìn)而加速機(jī)體衰老。因此ＳＯＤ含量的高低可以間接反映機(jī)體**自由基的能力，而ＭＤＡ含量的高低可以間接反映細(xì)胞的衰老程度。
近年來(lái)在**神經(jīng)性損傷方面的大量研究表明，ＨＪＤＴ在腦缺血、腦缺氧模型中可降低大鼠腦、肝、胰組織的ＭＤＡ含量，抑制過(guò)氧化脂質(zhì)的生成及消除氧自由基作用。能促進(jìn)腦缺血?jiǎng)游飳W(xué)習(xí)記憶行為，其作用機(jī)制可能與減少腦中自由基終產(chǎn)物ＭＤＡ含量、增加大腦皮質(zhì)和海馬組織腦血流量有關(guān)。在ＡＤ大鼠模型中，黃連**湯可以調(diào)整其**功能和增加**能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ＨＪＤＴ可以增加由Ｄ－半乳糖引起的衰老小鼠的ＳＯＤ活性，減少ＭＤＡ的產(chǎn)生。在行為學(xué)方面，模型組和ＨＪＤＴ各組對(duì)自發(fā)活動(dòng)中總路程、中央?yún)^(qū)的活動(dòng)路程以及中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著影響，但在跳臺(tái)試驗(yàn)中，ＨＪＤＴ能夠延長(zhǎng)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的潛伏期，減少錯(cuò)誤次數(shù)，相對(duì)于模型組，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。提示其作用機(jī)制可能與其增強(qiáng)對(duì)氧自由基的**作用，減少體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，改善Ｄ－半乳糖引起的氧化應(yīng)激損傷，防止細(xì)胞內(nèi)Ｃａ２＋超載從而起到抗氧化，抗衰老的作用有關(guān)，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研 究。從 藥 物 的 劑 量 上 看，以２ｇ／ｋｇ和４ｇ／ｋｇ劑 量 的ＨＪＤＴ的 效 果 較 為 明 顯，而８ｇ／ｋｇ的劑量在ＳＯＤ含量及跳臺(tái)試驗(yàn)中均作用不大。
綜上所述，中等劑量的ＨＪＤＴ能通過(guò)提高腦組織ＳＯＤ活性和降低ＭＤＡ含量，能有效地改善Ｄ－半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。
