眾多研究和臨床實(shí)踐表明, 腦內(nèi)DA 系統(tǒng)與動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)、記憶、情緒等活動(dòng)有密切關(guān)系。帕金森病 ( Park in son ’ s d isease, PD ) 就是原因不明的黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元變性丟失, 導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA 釋放量減少, 從而出現(xiàn)僵直、靜止性震顫和運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀, 并伴有癡呆發(fā)生。目前PD 大鼠模型大多以**誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)作為建模成功與否的觀察指標(biāo), 但此時(shí)黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元丟失80% 左右, 紋狀體DA 含量下降超過(guò) 90% , 相當(dāng)于臨床PD 晚期。利用開(kāi)野實(shí)驗(yàn)作為行為學(xué)觀察指標(biāo), 動(dòng)態(tài)觀察黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化與行為改變之間的關(guān)系, 相關(guān)報(bào)道還不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)利用 6-O HDA 特異毀損大鼠單側(cè)黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元, 在不同時(shí)間點(diǎn)觀察DA 能神經(jīng)元的病理變化, 丟失比例和行為學(xué)改變, 分析兩者之間的相關(guān)性, 以期為 PD 早期模型提供行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo), 為 PD 早期病理改變和神經(jīng)生化研究提供指導(dǎo)。

1　材料與方法

1. 1 　 儀 器 及 主 要 試 劑 　 腦立體定位儀 , 微量推進(jìn)器  , SuperMaze動(dòng)物行為圖像分析系統(tǒng)  , 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱，6-O HDA 、酪氨酸羥化酶 抗體 , SABC、 DAB 。

1. 2 　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組　健康 Sp rague2 D aw ley雄性大鼠 60 只 ( 安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供) ,體重 210 ～ 240g , 隨機(jī)分為正常對(duì)照組 ( N C ) ( n =10) , 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 ( EC ) ( n = 10) , 和實(shí)驗(yàn)組 ( n = 40) ,后者按處死時(shí)間不同隨機(jī)分成 4 組, 每組 10 只。

1. 3 　 6-O HDA 毀 損 　 7% 水 合 氯 醛 ( ip ,350 m g/kg ) 麻醉大鼠, 頭顱水平位固定在腦立體定位儀上, 門(mén)齒溝平面比耳間線平面低2. 4 mm , 剪去頭部毛, 切開(kāi)頭皮, 暴露顱骨前囟點(diǎn) ( 若不清晰, 可用3% H 2 O 2 擦洗) , 參照包新民等

著《大鼠腦立體定位 圖 譜》確 定 右 側(cè) SN c 區(qū) 坐 標(biāo) 前 囟 后 (A P )- 5. 2 mm , 右側(cè)旁開(kāi) (R ) 1. 3 mm , 深度 ( V ) 8. 0 mm ,顱骨鉆孔后 ( 切勿損傷軟腦膜) , 1L l 微量注射器插入右側(cè)SN c 區(qū), 注射8g /L 6-O HDA ( 溶于0. 2% V itC 生理鹽水溶液) 1L l, 利用微量推進(jìn)器緩慢推進(jìn) ( 0. 5L l/m in ) 。注射完畢, 留針5 m in 后緩慢拔針, 縫合皮膚并肌注硫酸慶大霉素 ( 5 m g/kg ) 預(yù)防感染, 清醒后置籠喂養(yǎng)。 EC 組僅注射0. 2% V itC 生理鹽水溶液1L l , N C組不手術(shù)。

1. 4 　開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn) (op en 2 f ield test )

　敞口木箱60cm ×60cm ×40cm , 里面涂成黑色, 箱底劃為 25 個(gè)方格 ( 12 cm ×12cm ) , 將大鼠放入正中一格, 10 s 后開(kāi)始記錄 15 m in 內(nèi)各項(xiàng)行為指標(biāo)。觀察指標(biāo): ( 1) 旋轉(zhuǎn)行為, 記錄左、右側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù), 按公式右側(cè)/( 左側(cè)+ 右側(cè)) 計(jì)算不對(duì)稱指數(shù); ( 2) 探究行為, 鼻子距離箱壁 5cm 以內(nèi)的跑動(dòng)時(shí)間; ( 3) 穿梭距離, 規(guī)定時(shí)間內(nèi)跑動(dòng)的格子數(shù) ( 二爪以上跨入鄰格為跑動(dòng)一格) ;( 4) 下肢站立, 雙上肢抬起離地 1cm 以上的次數(shù); ( 5)修飾次數(shù), 理毛、洗臉、舔舐次數(shù)。在毀損術(shù)后1d 、 3d 、5d 、 7d 、 14d 、 21d 各觀察 1 次, 每次實(shí)驗(yàn)均在 7: 00 ～12: 00 AM 進(jìn)行, 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暗光、安靜, 兩次實(shí)驗(yàn)之間將箱底打掃干凈。

1. 5　形態(tài)學(xué)觀察

1. 5. 1 　取材　分別在術(shù)后 1d 、 7d 、 14d 、 21d 行為學(xué)測(cè)試完畢, 7% 水合氯醛 ( ip , 350 m g/Kg) 麻醉大鼠, 置于冰盤(pán)上, 打開(kāi)胸腔, 暴露心臟, 先用 0. 9%N aC l 100 m l 經(jīng)心臟沖洗, 然后300 m l 4% 多聚甲醛灌注固定, 取出腦組織4% 多聚甲醛后固定24h。在針道旁冠狀面切開(kāi), 石蠟包埋, 連續(xù)切片, 片厚 6L m , 常規(guī)H E 染色。定位不在SN c 區(qū)的大鼠從該組剔除, 不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1. 5. 2　 N issl 染色　切片脫蠟至水, 0. 1% 硫堇冰醋酸水溶液染色15 ～ 20 m in, 95% 酒精快速分色 ( 2～ 3 s 即可) , 脫水、透明、封片、鏡檢。

1. 5. 3　**組織化學(xué)染色 ( ABC 法) 　切片脫蠟至水后經(jīng) 3% H 2 O 2 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶, 微波抗原修復(fù) 2 次, 正常山羊血清封閉 20 m in 后, 1 ∶500TH 一抗 4℃冰箱孵育過(guò)夜, 滴加生物素化二抗和 SABC 37℃各孵育 20 m in。其間, 各步驟間均用0. 01 mo l/L PBS (pH 7. 2) 充分洗滌, *后加DAB 顯色 ( 鏡檢控制顯色時(shí)間) , 常規(guī)脫水、透明、封片、鏡

檢。

1. 5. 4　電鏡觀察　灌注固定后, 分離黑質(zhì)和紋狀體約 1 mm

3, 2. 5% 戊二醛、 1% 鋨酸雙重固定, 脫水, Epon 812 包埋, L KB- NOVA 切片機(jī)超薄切片,醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色, 透射電鏡觀察。

1. 5. 5 　圖像分析　采用江蘇捷達(dá)圖像分析系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像分析, 根據(jù)N issl 染色圈出黑質(zhì)范圍, 采用同一放大倍數(shù) ( ×100) , 同一光強(qiáng)度下測(cè)量陽(yáng)性數(shù)密度, 并按照公式: 100- ( 右側(cè)細(xì)胞數(shù)/ 左側(cè)細(xì)胞數(shù)) ×100, 計(jì)算DA 能神經(jīng)元?dú)p程度。

1. 5. 6 　統(tǒng)計(jì)方法　所有數(shù)據(jù)采用X ±s 表示,SPSS11. 5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析, 采用單因素方差分析( ANOVA ) 進(jìn)行組間比較, *小有意義差異 t 檢驗(yàn)( L SD -t) 進(jìn)行組內(nèi)兩兩比較, 開(kāi)野實(shí)驗(yàn)各參數(shù)與黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元?dú)p比例作 Pear son’ s 相關(guān)分析。

2　結(jié)　果

2. 1　開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果　 ( 1) 旋轉(zhuǎn)行為: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 05) 。在術(shù)后 1d 右側(cè)旋轉(zhuǎn)行為增多 ( 與對(duì)照組比較P < 0. 05) , 3d 、 5d 恢復(fù)到對(duì)照組水平 ( P > 0. 05, 與 1d 、 14d 、 21d 組比較 P <0. 05 ) , 而后右側(cè)旋轉(zhuǎn)又逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì) ( 14d 、 21d 組與對(duì)照組比較 P < 0. 05) ; ( 2) 探究行為: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01) 。術(shù)后 1d 較對(duì)照組大幅減少( P < 0. 01 ) , 3d 、 5d 接近對(duì)照組水平 ( P > 0. 05, 與1d 、 7d 、 14d 、 21d 組比較 P < 0. 01 ) , 此后逐漸降至較低水平 ( 與對(duì)照組比較 P < 0. 01) ; ( 3) 穿梭距離: 組間比較差異有顯著性 ( P < 0. 01) 。實(shí)驗(yàn)組變化趨勢(shì)呈正態(tài)分布, 1d 、 14d 、 21d 組與5d 組及對(duì)照組比較差異有顯著性 (P < 0. 01) , 5d 組與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性 ( P > 0. 05 ) ; ( 4) 下肢站立: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01) 。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有顯著性 (P < 0. 01) , 3d 、 5d 組也有恢復(fù)傾向 ( 與 1d 、21d 組比較 P < 0. 05 ) , 但與對(duì)照組相比仍處于較低水平; ( 5) 修飾行為: 變化沒(méi)有規(guī)律性, 組間比較差異

無(wú)顯著性 (P > 0. 05) 。

2. 2　形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果　 ( 1) H E 染色和N issl 染色顯示, 從 1d ～ 21d 大鼠 6-2 O HDA 注射側(cè)SN c 區(qū)神經(jīng)元較對(duì)側(cè)明顯減少, 尼氏體著色較對(duì)側(cè)淡, 針道及毀損區(qū)可見(jiàn)不同程度膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn), 對(duì)照組左右側(cè)細(xì)胞數(shù)均無(wú)明顯變化。( 2) **組化染色顯示 , TH 陽(yáng)性神經(jīng)元隨時(shí)間推移逐漸減少, 毀損比例不斷增大, 沒(méi)有恢復(fù)傾向, 對(duì)照組無(wú)明顯變化。( 3) 電鏡結(jié)果從1 ～ 21d 大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷逐漸加重, 線粒體腫脹、嵴

消失, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體也有腫脹; 21d 神經(jīng)元水腫, 游離核糖體減少, 溶酶體增多; 在紋狀體則有髓鞘松解斷裂, 突觸小泡多為清亮型, 顆粒小泡極少甚至看不見(jiàn)。

2. 3 　相關(guān)分析結(jié)果　旋轉(zhuǎn)行為與黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元?dú)p比例呈正相關(guān) ( r = 0. 471, P < 0. 01) ; 探究行為、穿梭距離、下肢站立行為均與毀損比例呈負(fù)相關(guān) ( r = - 0. 719 、 - 0. 594 、 - 0. 589, P < 0. 01 ) ; 修飾行為與毀損比例無(wú)相關(guān)性( r= - 0. 227, P > 0. 05) 。

　　3　討　論

DA 作為內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)作用于基底核 ( basalgang lia) 的 D 1 、 D 2 受體, 平衡調(diào)節(jié)基底核為中心的直接和間接神經(jīng)回路功能?；缀瞬⒉话l(fā)布對(duì)肌肉收縮的命令, 而是通過(guò)選擇不同的神經(jīng)元發(fā)放電活動(dòng),參與隨意運(yùn)動(dòng)的程序編制和運(yùn)動(dòng)程序的執(zhí)行, 在調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)的組成、方向、順序、速度和幅度等方面發(fā)揮其作用。 PD 由于 SN c 區(qū)DA 能神經(jīng)元退變, 導(dǎo)致紋狀體DA 含量下降, DA 對(duì)間接回路的去抑制和對(duì)直接回路的興奮兩種功能?chē)?yán)重喪失, 導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示, 實(shí)驗(yàn)組大鼠在毀損術(shù)后 1d 即有明顯行為學(xué)改變, 其中旋轉(zhuǎn)、探究、后肢站立和穿梭行為與黑質(zhì) DA 能神經(jīng)元丟失比例有很好的相關(guān)性,而正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠的行為在實(shí)驗(yàn)前后沒(méi)有明顯改變。腦內(nèi)DA 神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的代償功能, 如 PD患者在出現(xiàn)臨床癥狀時(shí) SN c 區(qū)DA 能神經(jīng)元丟失已達(dá)80% 以上, PD 模型大鼠由于 DA 受體超敏出現(xiàn) DA激動(dòng)劑誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)等。在我們的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中也觀察到這種代償現(xiàn)象, 開(kāi)野實(shí)驗(yàn)的旋轉(zhuǎn)、探究、后肢站立和穿梭行為指標(biāo)在術(shù)后 3d 、 5d 有趨于改善的

傾向, 其可能機(jī)制: ( 1) DA 更新率增加, 殘存的DA 能神經(jīng)元合成和釋放DA 的能力增強(qiáng); ( 2)DA 受體超敏, 包括受體敏感性增強(qiáng)和受體數(shù)目的增加;( 3) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增強(qiáng), 如 Gs 蛋白上調(diào), A C 酶活力提高, 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶 ( ex tracellu larsignal2regu lated k inase, ER K ) 的活化等。我們的實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)修飾行為與黑質(zhì)毀損比例有相關(guān)性, 但Ber r idge大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的相關(guān)性研究

指出紋狀體在修飾行為的整合中起重要作用, 如果毀損雙側(cè)紋狀體前外側(cè)部, 則將打破修飾行為鏈。因此, 我們認(rèn)為毀損一側(cè)SN c 區(qū)只能導(dǎo)致一側(cè)紋狀體 DA 含量下降, 而健側(cè)紋狀體足以發(fā)揮代償作用, 保持修飾行為鏈的完整性。另外, 可能與環(huán)境變化、手術(shù)損傷、麻醉等外界因素和觀察時(shí)間不夠也有一定的關(guān)系。6-O HDA 即 2. 4. 52 三羥基苯乙胺, 是一種選擇性兒茶酚胺能神經(jīng)元化學(xué)毀損劑, 單獨(dú)或聯(lián)合注射到大鼠 SN c 、內(nèi)側(cè)前腦束 ( M FB ) 、紋狀體 (Cp u ) 、腹側(cè)被蓋區(qū) ( V TA ) 等不同腦區(qū), 選擇性地毀損DA 和N E能神經(jīng)元 ( 尤其對(duì)前者作用更顯著) 制作不同程度損害的PD 模型。其作用機(jī)制是: 6-O HDA 通過(guò)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入 DA 能神經(jīng)元, 快速氧化生成氧自由基( O 2-和·O H ) , 抑制線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物É , 并激活 casp ase 啟動(dòng)細(xì)胞凋亡, 從而導(dǎo)致黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元丟失。在我們的實(shí)驗(yàn)中, 6-O HDA SN c 區(qū)注射后24h 即有50% 以上的DA 能神經(jīng)元丟失, 而后隨時(shí)間推移毀損比例不斷增大。**組化切片經(jīng)N issl復(fù)染發(fā)現(xiàn), 非 DA 能神經(jīng)元形態(tài)完整, 數(shù)量并不減少,在早期甚至有增多現(xiàn)象, 這說(shuō)明 6-O HDA 是一種實(shí)用可靠的特異性 DA 能神經(jīng)毒劑。但該法制作的模型仍屬于急性損傷完全毀損模型, DA 神經(jīng)元在注藥后4h 即可見(jiàn)丟失。若用**誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)作為鑒定標(biāo)準(zhǔn), 一般為術(shù)后 2 ～ 3 周陽(yáng)性, DA 神經(jīng)系統(tǒng)毀損已相當(dāng)嚴(yán)重, 不利于觀察輕中度毀損模型。許多研究指出, 對(duì)輕中度毀損模型的研究更有助于對(duì)臨床 PD 早期患者病理形態(tài)、神經(jīng)生化和輕度行為異常的了解,有 助于 PD 病因、發(fā)病機(jī)制和**、細(xì)胞移植及基因**的研究。因此, 建立一個(gè)敏感反映輕中度毀損的行為學(xué)觀測(cè)指標(biāo), 具有較大的現(xiàn)實(shí)意義。我們利用開(kāi)野實(shí)驗(yàn)對(duì)毀損早期的大鼠進(jìn)行行為學(xué)的觀察, 發(fā)現(xiàn)術(shù)后 1d 各項(xiàng)指標(biāo)即已發(fā)生明顯改變, 并能很好地動(dòng)態(tài)反映 DA 毀損程度。開(kāi)野實(shí)驗(yàn)不僅適用于輕中度毀損模型的觀測(cè), 還能反映毀損早期機(jī)體的代償情況,并且各參數(shù)間可相互佐證, *大程度地減少主觀因素的影響。因此, 我們認(rèn)為開(kāi)野實(shí)驗(yàn)是一個(gè)很好的反映DA 神經(jīng)系統(tǒng)毀損程度的行為學(xué)觀察指標(biāo)。大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的相關(guān)性研究。