Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)對(duì)子代小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響機(jī)制

Ø 【摘 要】                                                                 

    目的 探討富含α- 亞麻酸(α- LNA) 的胡麻籽油( 亞麻油) 對(duì)子代小鼠腦發(fā)育及功能的影響。方法取性成熟小鼠45只,雌雄為2 ∶1 , 將懷孕雌鼠隨機(jī)分為4 組, 分別給予胡麻籽油2 g (A組) 、5 g (B組) 、10 g (C組) /kg 體重和對(duì)照組(0組) , 連續(xù)給孕鼠經(jīng)口灌胃至仔鼠斷乳,母鼠處死, 將仔鼠雌雄分籠, 雄鼠立即處死進(jìn)行腦體重量測(cè)定并計(jì)算腦體比; 再將雌鼠C組分為C 組和D 組, A、B、C 組雌鼠繼續(xù)按母鼠劑量補(bǔ)充胡麻籽油, 每天1次, D 組不補(bǔ)充胡麻油繼續(xù)喂養(yǎng); 5 周后進(jìn)行小鼠避暗和水迷宮實(shí)驗(yàn), 測(cè)定后取腦進(jìn)行蛋白質(zhì)(TPRO) 、乙酰膽堿脂酶( AChE )及一氧化氮(NO) 指標(biāo)測(cè)定。結(jié)果 ①子鼠體重隨劑量的增加而下降, C組下降明顯, 與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05) , 腦體比各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。②水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: B 組、D 組與對(duì)照組比較游泳時(shí)間縮短, 錯(cuò)誤次數(shù)減少( P<0.05 ) ; 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各劑量組的潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng), 而錯(cuò)誤次數(shù)減少, 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③TPRO 隨劑量的增加而增高, D 組較0 組和A 組明顯增高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05) ; Ac hE 各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; NO 含量A 組較C 組有明顯增高(P<0.05) , 較B、D 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.01 ) 。結(jié)論 在小鼠胚胎期及嬰幼期補(bǔ)充胡麻籽油可提高腦內(nèi)蛋白質(zhì)含量, 促進(jìn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力, 可引起腦內(nèi)NO 含量的變化。儀器參考網(wǎng)站上海欣軟公司www.bjhstn.com。

Ø 【關(guān)鍵詞】                                                                 

α- 亞麻酸; 記憶; 神經(jīng)遞質(zhì); 亞麻籽油

    胡麻籽油又稱亞麻籽油, 是我國(guó)西北和晉西北等地區(qū)主要的食用油, 資料顯示, 胡麻籽油中α- 亞麻酸(α- LNA) 含量達(dá)61.27%[ 1] 是植物油中含量*高的。α- LNA 為n - 3 系多不飽和脂肪酸,是人體必需脂肪酸, 在體內(nèi)可有效地轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘉逑┧?EPA) 和二十二碳六烯酸(DHA) , 而發(fā)揮其生理功能。多年來(lái)關(guān)于n - 3 系多不飽和脂肪酸, 尤其是DHA( 魚(yú)油的主要成分) 在促進(jìn)大腦發(fā)育及視網(wǎng)膜功能方面的作用被研究證實(shí); 此外與胡麻籽油結(jié)構(gòu)及α- LNA 含量相近( 50%以上) 的紫蘇籽油被實(shí)驗(yàn)證明有促進(jìn)小鼠學(xué)習(xí)記憶的作用。本實(shí)驗(yàn)以胡麻籽油作為α- LNA 的來(lái)源, 對(duì)攝入胡麻籽油的小鼠進(jìn)行了學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)部分神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)試, 以觀察胡麻籽油對(duì)胚胎及生長(zhǎng)發(fā)育期小鼠腦發(fā)育的影響,為更好開(kāi)發(fā)胡麻籽油提供依據(jù)。

Ø 材料與方法                                                                  

1.1 樣品來(lái)源

胡麻籽油: 產(chǎn)自山西省五寨縣, 胡麻籽經(jīng)超臨界CO2 提取,α- LNA 含量為50.50% 。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與基礎(chǔ)飼料

選性成熟昆明種小鼠45 只, 雌性30 只, 雄性15 只; 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料均購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 儀器

小鼠水迷宮儀、XR-XC105 型小鼠被動(dòng)回避條件反射儀;1.4 試劑一氧化氮( NO) 、乙酰膽堿酯酶( AChE ) 和蛋白質(zhì)( TPRO) 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,其余試劑均為市售分析純。Morris水迷宮系統(tǒng)可由上海欣軟信息科技有限公司提供。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 劑量分組與喂養(yǎng): 選性成熟小鼠雌性30 只,雄性15 只, 以2 ∶1 進(jìn)行合籠, 次晨以查到精子為受孕0 d , 自妊娠0 d 起雌鼠分籠飼養(yǎng), 將孕鼠隨機(jī)分為4 組, 即A、B、C 3 個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組( 0 組) ,在受孕第0 天起分別給予A、B、C 為2 、5 、10 g/kg 體重的胡麻籽油, 連續(xù)灌胃至子鼠斷乳, 新生鼠出生后調(diào)整每窩仔鼠數(shù)6～9 只, 將斷乳仔鼠雌雄分開(kāi), 雄鼠立即處死進(jìn)行腦體重量測(cè)定并計(jì)算腦體比; 將雌鼠C 組分為數(shù)量相同兩組即C 和D 組, 除D 組不給胡麻籽油外, 其余繼續(xù)按母鼠劑量補(bǔ)充胡麻籽油, 每天1 次, 連續(xù)5 周。

1.5.2 腦重測(cè)定: 分別取斷乳和56 d 齡子鼠稱重,斷頭后取腦組織稱重, 計(jì)算腦體比。

1.5.3 小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn): 將補(bǔ)充胡麻籽油5 周后仔鼠每組隨機(jī)選10 只開(kāi)始訓(xùn)練, 訓(xùn)練期間繼續(xù)給受試物, 每天1 次。迷宮泳道水深15 cm, 水溫( 25±1 ) ℃。實(shí)驗(yàn)時(shí), 將小鼠放于泳道的起點(diǎn)處, 開(kāi)始計(jì)時(shí), 觀察其到達(dá)終點(diǎn)所需時(shí)間, 以及出現(xiàn)錯(cuò)誤次數(shù)。將小鼠訓(xùn)練時(shí)間限定為120 s , 在120 s 內(nèi)未到達(dá)終點(diǎn)的小鼠均記為120 s 。共訓(xùn)練5 d , 末次從起點(diǎn)進(jìn)行訓(xùn)練。*后計(jì)算各組動(dòng)物的錯(cuò)誤次數(shù), 到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間及到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)。

1.5.4 小鼠避暗實(shí)驗(yàn): 將補(bǔ)充胡麻籽油5 周后仔鼠每組隨機(jī)選10 只, 進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn), 記錄每鼠從放入明室到進(jìn)入暗室遭電擊所需的時(shí)間, 此即潛伏期, 訓(xùn)練5 min , 并記錄5 min 內(nèi)電擊次數(shù), 24 h 后重做測(cè)驗(yàn), 記錄每只動(dòng)物進(jìn)入暗室的潛伏期和5 min 內(nèi)的電擊次數(shù), 以此作為記憶的成績(jī)。

1.5.5 TPRO、NO、AChE 的測(cè)定: 測(cè)試完水迷宮實(shí)驗(yàn)的小鼠處死, 取腦在4 ℃下勻漿, 進(jìn)行TPRO、AChE和NO 測(cè)定, 方法由南京建成生物工程研究所提供。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 采用單因素方差分析、泊松分布及非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法。

Ø 結(jié) 果                                                                        

2.1 腦體比: 表1 結(jié)果顯示斷乳期小鼠體重、腦體比各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P >0.05 ) ,而56 d 齡小鼠隨劑量的增加體重明顯下降, C 組與各劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P <0.05 ) , 腦體比C 組也相對(duì)增加, 較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05 ) 。

2.2 小鼠學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn): 見(jiàn)表2 。從表2 結(jié)果顯示小鼠游出迷宮游出時(shí)間B 組與D 組縮短, 錯(cuò)誤次數(shù)減少, 與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05 ) 。小鼠避暗潛伏期劑量組有延長(zhǎng)趨勢(shì), 錯(cuò)誤次數(shù)減少, 但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P>0.05 ) 。

2.3 小鼠腦組織TPRO、NO、AChE 測(cè)定結(jié)果TPRO 含量有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系, D 組較0 組和A 組明顯增高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, D:0 為P <0.01 , D:A 為P <0.05 ; NO 測(cè)定中, B、C、D 組較對(duì)照組明顯降低, A 組增高明顯, 與C 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05 ) , A 組與B、D 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P <0.01 ) , A 組與0 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; AChE 雖比B、C 組明顯增高, 但各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Ø 討 論                                                                        

     本實(shí)驗(yàn)在孕乳期至子鼠56 d 齡期間分別給孕母鼠及子鼠補(bǔ)充胡麻籽油作為α- LNA 的來(lái)源, 經(jīng)行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明胡麻籽油有促進(jìn)小鼠學(xué)習(xí)與記憶的作用, 與紫蘇油促進(jìn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的研究報(bào)道相符, 但其作用與攝入量不成正比, C 組作用減弱, 這可能與過(guò)量的不飽和脂肪酸攝入產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān), 有待進(jìn)一步研究。而且D 組學(xué)習(xí)記憶能力的明顯增強(qiáng)也表明即使在斷乳后終止補(bǔ)充α- LNA, 子鼠從母體獲取n- 3 系列多不飽和脂肪酸仍能發(fā)揮其生物效應(yīng)。在胚胎及嬰兒腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的****需要補(bǔ)充更多n - 3 系列多不飽和脂肪酸, 而此階段動(dòng)物腦和肝臟合成DHA 的酶系統(tǒng)不健全, 去飽和酶活力水平較低, 在嬰兒體內(nèi)利用α- LNA 合成DHA 的能力很低, 其主要從母體和乳汁中獲得。另?yè)?jù)報(bào)道DHA 在妊娠期和嬰兒期快速積累于嬰兒組織中, 其來(lái)源于母體的貯備, 即孕期由膳食直接供給或由膳食中α- LNA 在體內(nèi)的合成, 通過(guò)胎盤選擇轉(zhuǎn)運(yùn)完成。因而給孕鼠補(bǔ)充α- LNA 對(duì)促進(jìn)子鼠腦發(fā)育是有益的。

     TPRO、NO 與AchE 與腦功能有密切關(guān)系, 學(xué)習(xí)記憶時(shí)蛋白質(zhì)合成增加并有新的蛋白質(zhì)或肽產(chǎn)生, 蛋白質(zhì)水平影響子代腦發(fā)育和功能。本實(shí)驗(yàn)?zāi)X內(nèi)蛋白質(zhì)含量隨劑量的增加而增高, 表明α- LNA 能影響腦蛋白質(zhì)的合成從而影響腦發(fā)育及功能; NO 是近年來(lái)被認(rèn)識(shí)的一種神經(jīng)遞質(zhì), 釋放適量的NO 可促進(jìn)學(xué)習(xí)能力, 并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出NO 對(duì)初生小鼠學(xué)習(xí)記憶過(guò)程及記憶的再現(xiàn)起中心調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)56 d 齡子鼠腦NO 測(cè)試顯示在不同劑量組較0組有升高也有下降, A 組明顯升高, 但與0 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, A 組與C 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05 ) , B、D 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.01 ) 。表明攝入不同劑量的α- LNA 對(duì)腦內(nèi)NO 影響各異, 是否與其中心調(diào)控作用有關(guān)及其他原因有待進(jìn)一步探討; 乙酰膽堿是腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì), 與認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等大腦**神經(jīng)功能有關(guān), 學(xué)習(xí)、記憶任務(wù)的完成伴隨著腦內(nèi)乙酰膽堿的變化。AChE 是乙酰膽堿的分解酶, 它的活力變化可間接反映腦內(nèi)乙酰膽堿含量。